一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法与流程

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体地说是一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法。

背景技术：

工业大麻(steviarebaudianabertoni)为大麻科大麻属一年生雌雄异株的草本植物，广泛分布于世界各地。世界上大麻属植物主要有野生大麻(cannabisruderalisjanisch)、印度大麻(cannabisindicalam)和栽培大麻(cannabissatival)3个种，在长期的生物进化过程中又产生了许多大麻变种和亚种。由于大麻中含有一种致幻成瘾的次生代谢产物—四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，thc)，因而成为公众熟知的毒品原植物之一。为了方便监管和合理使用，国际上将大麻中thc含量<0.3％的大麻品种定义不具备毒品利用价值的工业大麻。目前世界上种植工业大麻的国家已达27个，培育出的符合thc含量<0.3％的工业大麻品种26个。工业大麻植株高大，枝杈少，纤维含量高，其经济价值涉及造纸、纺织、建材、食品、医药等多个方面。

已有研究表明，工业大麻中非成瘾性成分大麻二酚(cannabidiol，cbd)具有抗炎、杀菌、镇痛、抗焦虑、抗精神病、抗氧化、改善学习记忆、神经保护和减少肠蠕动等作用，可用于治疗多发性动脉硬化与帕金森病、预防心肌梗死、阻断乳腺癌转移、抑制神经胶质瘤细胞转移和抑制性激素分泌等，也可用于治疗青光眼、截瘫与多发性硬化症病人的痉挛状态及运动障碍、癌痛、神经痛、偏头痛、癫痫等作用。因此，大力开发和利用工业大麻是一项利国利民和保护自然生态环境的绿色工程，其多样化制品具有广阔的国际市场。

目前，许多国家通过品种选育与改良、杂交与基因工程育种手段，已经选育出了很多优良工业大麻的新品种。我国也对工业大麻的种植和育种方面进行了不断的探索。如云南省农业科学院率先选育出云麻1号、云麻2号、云麻3号、云麻4号和云麻5号、云麻6号、云麻7号等多个云麻系列的工业大麻品种，这些品种在国内已有推广种植，如在内蒙古、黑龙江、安徽等地都有栽培应用。

但是，目前虽然对于工业大麻的药用成分大麻二酚的提取方法和分析已有较多研究报道，但这些提取方法不够完善，大多未采用细胞壁分解酶直接提取，导致大麻二酚提取的含量较低，而且虽然使用细胞壁分解酶也基本上单独用纤维素酶或者果胶酶，其结果虽然比不使用细胞壁分解酶对大麻二酚的得率有所提高，但毕竟工业大麻叶片细胞壁中含有大量纤维素和果胶质，所以利用纤维素酶和果胶酶同时作为提取溶剂，则大麻二酚含量的得率将有所提高。

因此，我们利用纤维素酶和果胶酶的混合液作为细胞壁分解酶，对工业大麻叶中大麻二酚的提取方法进行了优化和完善，旨在为更好地为工业大麻产业发展提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法，该方法具有提高大麻二酚提取率的特点，可以解决现有技术中存在的工业大麻叶片中大麻二酚提取率低的问题。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法的步骤包括：取工业大麻叶片，干燥粉碎，加入细胞壁分解酶纤维素酶和果胶酶混合液后，水解，然后加入萃取溶剂搅拌萃取；将萃取上清液进行旋蒸得到油状物；在油状物中加入甲醇，低温离心获取上清液，对上清液活性炭脱色，脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后在旋蒸产物中加入氯仿溶解后通过有机膜膜过滤，即可获得工业大麻二酚溶液。

工业大麻叶片选用云麻7号品种的工业大麻叶片。

细胞壁分解酶采用纤维素酶和果胶酶的混合液。

细胞壁分解酶的添加量为按工业大麻叶片重和酶液量1:10g:ml加入含有相对于工业大麻叶片质量浓度为0.5％的酶液量。

萃取溶剂采用正己烷。

甲醇的加入剂量按油状物与甲醇为1:5的质量比例加入甲醇。

上清液活性炭脱色采用在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min。

旋蒸过程采用旋转蒸发仪进行旋蒸。

一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法的优选工艺步骤是：称取干燥粉碎的工业大麻品种为云麻7号的叶片10g，按1g:10ml的比例加入含有相对于工业大麻叶片质量浓度为0.5％的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液后，在摇床内水解1h，然后加入400ml萃取溶剂正己烷，置于转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h；将上清液在旋转蒸发仪上进行旋蒸得到油状物；按油状物与甲醇为1:5的质量比例加入甲醇，置于-40℃的低温条件下静置1h后，同等低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min；脱色后过滤所得的滤液再次进行旋蒸；然后称取旋蒸产物，加入氯仿溶解5min后过0.22μm有机膜，即可获得工业大麻二酚溶液。利用高效液相色谱仪进行检测。

细胞壁分解酶在提取工业大麻叶中大麻二酚中的应用，细胞壁分解酶采用纤维素酶和果胶酶的混合液。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

本发明的一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法可以大大提高大麻二酚的提取率，可以解决现有技术中存在的工业大麻叶片中大麻二酚提取率低的问题。

本发明的方法具有快速，高回收率的特性。

本发明的一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法设计合理、工艺安全可靠，具有良好的推广使用价值。

附图说明

附图1：为工业大麻品种‘云麻7号’植株；

附图2：为利用细胞壁分解酶提取后的cbd高效液相色谱图；

附图3：为对照的cbd高效液相色谱图；

附图4：cbd标样的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法作以下详细说明。

如附图所示，本发明的一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法，利用国内优良工业大麻品种，通过高效液相色谱仪检测后，选取了cbd含量较高的工业大麻品种云麻7号，采取干燥粉碎的叶片作为原材料，利用细胞壁分解酶提取工业大麻叶片中大麻二酚，其方法具体如下：包括以下步骤：

(1)称取工业大麻叶片样品放入试管中，然后向试管中加入纤维素酶和果胶酶混合溶剂。

工业大麻叶片样品为干燥粉碎重量10.0g，试管中加入含有相对于工业大麻叶片0.5％的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液体积为100ml，料液比为1:10(g:ml)，在摇床上摇动水解1h。

(2)将上述混合溶液在摇床上充分水解，并静置一段时间后，加入正己烷，并置于搅拌器中快速搅拌后，利用旋转蒸发仪旋蒸，其旋蒸产物中加入甲醇后离心获得上清液。

正己烷的体积为400ml，并在转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h。

旋蒸产物与甲醇为1:5的比例加入甲醇，置于-40℃的冰箱内静置1h后，低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％的活性炭脱色30min。过滤所得的滤液再次进行旋蒸。

(3)将上述上清液中加入活性炭脱色后，过滤所得的滤液再次进行旋蒸。然后在旋蒸产物中，加入氯仿溶解后用有机膜过滤。即可获得工业大麻二酚溶液。利用高效液相色谱仪进行检测。得到样品中大麻二酚cbd组分的色谱峰面积，按照外标法以峰面积定量计算大麻二酚cbd的含量。

按1:50比例加入氯仿溶解5min后，过0.22μm有机膜。

实施例：

本发明的一种提取工业大麻叶中大麻二酚的方法的步骤是：称取干燥粉碎的工业大麻‘云麻7号’叶片10g，按1:10(g:ml)加入含有相对于工业大麻叶片0.5％质量的酶量的纤维素酶和果胶酶混合液后，在摇床内水解1h，然后加入400ml萃取溶剂正己烷，置于转速为1000r/min的搅拌器中快速搅拌3.0h。将上清液在旋转蒸发仪上进行旋蒸得到油状物。按油状物与甲醇为1:5质量比的比例加入甲醇，置于-40℃的冰箱内静置1h后，低温条件下离心获取上清液，在上清液中加入相对于油状物10％质量的活性炭脱色30min。过滤所得的滤液再次进行旋蒸。然后称取0.1g旋蒸产物，加入5ml氯仿溶解5min后过0.22μm有机膜，即可获得工业大麻二酚溶液。利用高效液相色谱仪进行检测。本发明具有快速，高回收率的特性。

此方法提取的结果表明，利用细胞壁分解酶提取的大麻二酚得率与未加细胞壁分解酶的对照得率显著提高。本发明的方法具有快速，高回收率的特性。

本发明提供的利用细胞壁分解酶提取工业大麻叶片中大麻二酚得率(0.23％)与未加细胞壁分解酶的对照得率(0.18％)相比，提高了1.28倍，由此提高了大麻二酚的提取效果。