表达错义突变的FLNB基因的细胞模型、构建方法与应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种表达错义突变的flnb基因的细胞模型、构建方法与应用。

背景技术：

已有研究表明，非随机性分布的细丝蛋白b基因(filaminb，flnb)错义突变位点可导致一组常染色体显性遗传、继发于骨发育不良(bonehypoplasia)的骨骼畸形疾病，包括larsen综合征(larsensyndrome，ls)、骨发育不全症(atelosteogenesis，ao)、回飞镖样骨发育不全症(boomerangdysplasia，bd)。非随机分布的flnb基因无义突变可以导致另外一种隐形遗传的骨骼畸形疾病，即脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsalsynostosissyndrome,sct)。ls是位于该疾病谱中骨发育不良程度最低的一端，而bd则位于该疾病谱中骨发育不良程度最高的一端。ls表现出的骨骼畸形包括脊柱侧凸、颈椎后凸畸形、腕骨及跗骨增多、大关节的脱位和诸如前额突起、眼距增宽及鼻梁塌陷等畸形。bd是一种致死性骨发育不良疾病，其特征为肢体长骨、椎体及髋臼的发育不良，甚至是上述骨结构的缺损或完全缺失。脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsalsynostosissyndrome,sct,omim272460)，其典型表现为腕骨或跗骨的提前融合、及由椎体间融合导致的脊柱生长不平衡而进而引起的脊柱侧凸畸形。

根据现有报道，flnb基因突变对骨骼畸形的致病性机理包括长骨生长板骨化延迟、软骨细胞的迁移能力下降以及软骨细胞的增殖、分化及凋亡过程的紊乱。然而，这些研究中大部分都集中在出现数量较少的flnb无义突变导致的sct上，而对于出现数量较多的flnb基因错义突变导致的疾病，则研究较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种表达突变的flnb基因的细胞模型，该模型为研究错义突变的flnb基因导致的疾病提供了研究基础。

为实现上述目的，本发明首先提供一种表达突变的flnb基因的细胞模型，其特征在于，所述表达突变的flnb基因所用的细胞为atdc5细胞。

优选地，所述突变的flnb基因包括含有突变位点c.4756g>a的flnb基因、含有突变位点c.512t>g的flnb基因、导致骨发育不良的突变基因、导致骨化中心提前融合的骨骼畸形疾病的突变基因或导致先天性脊柱侧凸的突变基因。

优选地，所述flnb基因不同位点的突变，通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡，可导致所述atdc5细胞产生不同的的骨骼系统畸形的表型。本发明的第二方面提供了以上所述细胞模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)flnb全长cdna基因的5’端组装标记基因后进行扩增；

(2)将步骤(1)中获得的基因进行位点c.4756g>a或位点c.512t>g的定点突变；

(3)将步骤(2)中获得的突变基因与载体相连构建表达载体；

(4)将步骤(3)获得的表达载体通过转染导入atdc5细胞，经过筛选及鉴定得到稳定表达错义突变的flnb基因的细胞模型。

优选地，步骤(1)中所述标记基因为增强绿色荧光蛋白基因。

优选地，步骤(2)中所述定点突变采用pcr诱导定点突变。

优选地，所述pcr诱导定点突变所使用引物如下：

flnb-g4756a-f:acaagactaggcgctatatgattggagtcacc

flnb-g4756a-r:atagcgcctagtcttgtcggggatgtaggtga

flnb-t512g-f:aagacggcaaagcccggggagccctggtagacagct

flnb-t512g-r:ccgggctttgccgtcttgccagttctggttaa。

优选地，步骤(3)中所述载体为pcr3.1(-)载体。

优选地，步骤(4)中所述转染使用jetprime转染试剂。

本发明的再一个方面，提供以上所述的细胞模型的以下任一应用：

(1)在作为larsen综合征细胞模型上的应用；

(2)在作为回飞镖样骨发育不全症细胞模型上的应用。

本发明的有益效果如下：

为研究flnb突变位点的致病机理，选择一个合适的细胞模型是开展细胞学及分子生物学实验的必要前提。前人关于flnb错义突变位点的致病机理研究进行的细胞实验部分主要是在hek293细胞中开展，或许与该细胞对flnb质粒具有较高的转染效率有关。但hek293细胞系来源于肾脏，申请人认为该细胞系并不能准确地模拟骨骼发育过程，因此对于对骨骼系统具有高度特异性的flnb基因，申请人认为该细胞系不是一个合适的细胞模型。本发明的表达突变的flnb基因的细胞模型以atdc5细胞为基础，由于atdc5细胞是一个具有前软骨(prechondrogenic)干细胞性质的细胞系，因此通过atdc5细胞可全面展现flnb基因对骨组织的高度特异性，如细胞形态、细胞迁移能力、凋亡率的改变,这些现象只能在转染了flnb^l171r和flnb^g1586r突变质粒的atdc5细胞中表现，而在转染了相同突变质粒的hek293的细胞中并无表现。本发明的实验结果充分表明flnb基因的生理及病理性功能具有显著的细胞类型特异性，也因此解释了为何flnb基因仅影响骨骼系统。

本发明还提出了不同位点的错义突变通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡，导致彼此间互不相同的骨骼系统畸形的表型。通过转染flnb^l171r和flnb^g1586r突变质粒的atdc5细胞，模拟了bd和ls两种疾病的软骨内成骨过程的起始阶段，为flnb在骨骼发育过程中的作用提供了新的研究方向。

附图说明

图1为本发明实施例1中的westernblot结果图。

图2为本发明实施例2中显微镜下atdc5细胞中flnb蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况图。

图3本发明实施例2中显微镜下hek293细胞中flnb蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况图。

图4-a为本发明实施例3中表达空载体的atdc5细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞8.67％，晚期凋亡细胞5.05％。图4-b为本发明实施例3中表达flnb^wt的atdc5细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞7.37％，晚期凋亡细胞4.48％。图4-c为本发明实施例3中表达flnb^l171r的atdc5细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞18.74％，晚期凋亡细胞25.16％。图4-d为本发明实施例3中表达flnb^g1586r的atdc5细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞6.44％，晚期凋亡细胞2.76％。图4-e为本发明实施例3中表达空载体、flnb^wt、flnb^l171r(与bd相关)和flnb^g1586r(与ls相关)的atdc5细胞的细胞凋亡率统计柱状图。

图5-a为本发明实施例3中表达空载体的hek293细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞5.89％，晚期凋亡细胞7.71％。图5-b为本发明实施例3中表达flnb^wt的hek293细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞4.77％，晚期凋亡细胞8.50％。图5-c为本发明实施例3中表达flnb^l171r的hek293细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞5.65％，晚期凋亡细胞8.19％。图5-d为本发明实施例3中表达flnb^g1586r的hek293细胞的细胞凋亡流式图；其中，早期凋亡细胞6.00％，晚期凋亡细胞9.43％。图5-e为本发明实施例3中表达空载体、flnb^wt、flnb^l171r(与bd相关)和flnb^g1586r(与ls相关)的hek293细胞的细胞凋亡率统计柱状图。

图6-a为本发明实施例4中显微镜下表达空载体的atdc5细胞迁移图；图6-b为本发明实施例4中显微镜下表达flnb^wt的atdc5细胞迁移图；图6-c为本发明实施例4中显微镜下表达flnb^l171r的atdc5细胞迁移图；图6-d为本发明实施例4中显微镜下表达flnb^g1586r的atdc5细胞迁移图；图6-e为本发明实施例4中显微镜下表达空载体、flnb^wt、flnb^l171r(与bd相关)和flnb^g1586r(与ls相关)的atdc5细胞迁移率统计柱状图；

图7-a为本发明实施例4中显微镜下表达空载体的hek293细胞迁移图；图7-b为本发明实施例4中显微镜下表达flnb^wt的hek293细胞迁移图；图7-c为本发明实施例4中显微镜下表达flnb^l171r的hek293细胞迁移图；图7-d为本发明实施例4中显微镜下表达flnb^g1586r的hek293细胞迁移图；图7-e为本发明实施例4中显微镜下表达空载体、flnb^wt、flnb^l171r(与bd相关)和flnb^g1586r(与ls相关)的hek293细胞迁移率统计柱状图；

图8a为本发明实施例5中的westernblot结果图。图8b为本发明实施例5中表达空载体、flnb^wt、flnb^l171r(与bd相关)及flnb^g1586r(与ls相关)的atdc5细胞中，不同分子标志物的表达量统计柱状图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。

本发明使用的主要实验材料、仪器及试剂：

主要材料：

本发明的flnb基因为已知基因，其全长cdna的参考序列号为：nm_001457.3；

本发明使用的野生型flnb质粒的构建方法见文献(danielpb,morgant,alanayy,bijlsmae,chotj,colet,collinsf,davida,devriendtk,faivrel,ikegawas,jacquemonts,jesicm,krakowd,liebrechtd,maitzs,marlins,moring,nishikubot,nishimurag,prescottt,scaranog,shafeghatiy,skovbyf,tsutsumis,whitefordm,zenkermandrobertsonsp.disease-associatedmutationsintheactin-bindingdomainoffilaminbcausecytoplasmicfocalaccumulationscorrelatingwithdiseaseseverity.hummutat2012；33:665-673.)；

hek293细胞从北京协和细胞资源中心(crc/pumc)购买，atdc5细胞购自美国模式菌种收集中心(atcc)。hek293和atdc5细胞都在含有10％胎牛血清的(fetalbovineserum,fbs)dmem培养液中培养，培养环境的温度为37℃，5％co2。在转染之前，将培养液更换为无抗生素的培养液；

pcr3.1(-)载体(invitrogen,carlsbad,ca)。

主要仪器：

免疫荧光共聚焦显微镜(japanolympus)；

流式细胞仪(beckmancoulter(cytomicsfc500)。

主要试剂：

jetprime转染试剂(polyplus)；

lipofectaminernaimax转染试剂(usa,invitrogencompany)；

增强化学荧光(enhancedchemiluminescence，ecl)试剂盒(millipore)；

westernblot中使用的抗体：

anti-flnb(uk，abcam)；

anti-runx2(1:1000；catno.ab23981,abcam),anti-psmad3(磷酸化位点t179)(1:500；catno.ab193297,abcam),anti-psmad3(磷酸化位点：s423+s425)(1:1000；catno.ab52903,abcam),anti-smad3(1:3000；catno.ab75512,abcam),andanti-gapdh(1:1000；catno.sc-25778,santacruz)；

抗-兔igg(1:1000；catno.14708,cst)或抗-鼠igg(1:1000；catno.14079,cst)。

hoechst试剂(germany,agcompany)；

鬼笔环肽(phalloidin，usa,invitrogencompany)。

实施例1质粒构建和转染

一、质粒构建

在flnb全长cdna的5’端通过常规基因重组技术组装增强绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,egfp)，并将组装好的基因插入pcr3.1(-)载体上表达。对ls(larsen综合征)相关的突变位点c.4756g>a(p.gly1586arg)和bd(回飞镖样骨发育不全症)相关的突变位点c.512t>g(p.leu171arg),通过正向及反向引物，实现pcr突变形成(mutagenesis)以实现单核苷酸突变。

具体突变方法如下：

1、采用同源重组方法分别设计突变引物

flnb-g4756a-f:acaagactaggcgctatatgattggagtcacc(seqidno.1)

flnb-g4756a-r:atagcgcctagtcttgtcggggatgtaggtga(seqidno.2)

flnb-t512g-f:aagacggcaaagcccggggagccctggtagacagct(seqidno.3)

flnb-t512g-r:ccgggctttgccgtcttgccagttctggttaa(seqidno.4)

2、pcr扩增

分别用2对引物扩增flnb野生型质粒，扩增体系与条件均一样。

用东洋纺公司kod-neo-plus扩增试剂盒扩增，体系条件如下：

pcr条件如下：

反应体系：10×kodbuffer：5μl；dntp：5μl；mgso4：3μl；kod-neo-plus：1μl；flnb模板质粒：0.1μl；flnb-突变引物f：1.5μl；flnb-突变引物r：1.5μl；ddh2o：32.9μl；总计：50μl。

反应条件：

94℃，预变性2min，一个循环；98℃，变性10s；58℃，退火30s；68℃，延伸420s，30个循环。

1％琼脂糖凝胶分别回收上述pcr产物。

3、重组反应并转化

3.1重组体系

突变后pcr产物：1μl；2×重组buffer：5μl；ddh2o：4μl；总计10μl。

混匀后55℃连续反应30min。反应结束后立即将重组反应液冰浴5min。

3.2转化

在重组好的产物中加入50μltop10感受态细胞，混匀42℃热激60s，冰水浴120s，将转化好的混合物均匀地涂在含有氨苄抗性的lb平板中37℃过夜培养。

3.3阳性克隆筛选与鉴定

挑取单克隆进行pcr鉴定反应。

鉴定引物：

flnb-cx-2f：gctggggacactattcctaaga(seqidno.5)

flnb-cx-2r：ccctgttttccagcccattgag(seqidno.6)

3.4将阳性克隆送至北京擎科公司测序显示flnb野生型质粒突变成功。

二、转染细胞

使用jetprime转染试剂(polyplus)，按照试剂说明，将空载体、野生型flnb质粒、含有突变位点c.4756g>a(p.gly1586arg)的flnb的质粒及含有突变位点c.512t>g(p.leu171arg)的flnb的质粒分别转染至atdc5细胞中。

使用lipofectaminernaimax转染试剂(usa,invitrogencompany)，按照试剂说明，将上述质粒分别转染至hek293细胞中。48小时后收集细胞。

取部分细胞，提取总蛋白进行westernblot验证细胞内相关蛋白表达情况，westernblot具体步骤如下：

转染48小时后，消化细胞并制备单细胞悬液，离心后，弃除上清液，用pbs液重新吹散。在磷酸化酶抑制剂及蛋白酶抑制剂的保护下，使用ripa缓冲液(china,beijingsolarbio)分解细胞，4℃维持30min后用8,000rpm转速离心15min。使用蛋白定量试剂盒(bca，china,beijingsolarbio)对裂解的蛋白质进行定量，等量的蛋白(12μg)在12％凝胶(sds-page)中进行电泳分离，并转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，pvdf)膜上。在tbst(tris-bufferedsaline-tween)中，使用5％牛奶对pvdf膜进行封闭1小时,随后在bsa/tbst稀释的3％一抗中轻柔摇晃孵化，维持4℃过夜。次日用pbs液清洗三次，在室温中用二抗对pvdf膜孵化1h，随后用增强化学荧光(enhancedchemiluminescence，ecl)试剂盒及自动化学荧光曝光系统(tanon4200)对目标蛋白进行检测。使用image-j软件(https://imagej.nih.gov/ij/)对蛋白条带强度灰度值进行定量。重复三次实验，并用t-检验进行组间比较。

本实施例的westernblot中使用的抗体：

一抗：anti-flnb(uk，abcam)。

二抗：抗-兔igg(1:1000；catno.14708,cst)或抗-鼠igg(1:1000；catno.14079,cst)。

从图1中可以看出各种转染质粒在细胞中的表达情况。blank：未转任何质粒，只加转染试剂；wt：转染包含野生型flnb基因的质粒(pcr-flnb^wt-egfp质粒)；mut1：转染包含c.512t>g(p.leu171arg)突变位点flnb基因的质粒，(pcr-flnb^l171r-egfp质粒)；mut2：转染包含c.4756g>a(p.gly1586arg)突变位点flnb基因的质粒，(pcr-flnb^g1586r-egfp质粒)；marker：neb-proteinladder(p7711s)；按蛋白大小(flnb-egfp大小超过240kda，gapdh大小为37kda)将膜裁剪成两块，分别封闭，一抗二抗显色。

实施例2免疫荧光及照相分析flnb突变蛋白形态及分布

使用4％的多聚甲醛固定实施例1中转染后的细胞5min，随后使用pbs液清洗，并使用0.5μg/ml的hoechst试剂(germany,agcompany)对细胞核进行染色30min。使用鬼笔环肽(phalloidin，usa,invitrogencompany)对肌动蛋白(actin)细胞骨架进行染色。使用免疫荧光共聚焦显微镜(japanolympus)观察细胞。使用20ms的uv路径对hoechst染色曝光，使用波长488nm、时长100ms的激光对egfp进行曝光，使用波长590nm、时长1s的激光对鬼笔环肽进行曝光。

使用免疫荧光共聚焦显微镜观察atdc5细胞中flnb蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况(见图2)。细胞核用hoechst染色进行标记。在flnb^wt质粒转染的细胞中，增强绿色荧光蛋白(egfp)标记的flnb蛋白均匀地分布在细胞浆中，其分布情况和肌动蛋白细胞骨架(使用鬼笔环肽标记)一致。在bd相关的flnb^l171r突变质粒转染的atdc5细胞中，可以观察到flnb突变蛋白和肌动蛋白在胞浆中的同一部位出现球形聚集现象。在ls相关的flnb^g1586r突变质粒转染的atdc5细胞中，并未发现明显的flnb蛋白和肌动蛋白的聚集现象。

使用免疫荧光共聚焦显微镜观察hek293细胞中flnb蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况(见图3)。观察到flnb蛋白和肌动蛋白在胞浆中结合并凝聚。细胞核用hoechst染色标记。在表达flnb^wt和flnb^g1586r(与ls相关)的hek293细胞中，用绿色荧光蛋白(egfp)标记的flnb蛋白在胞浆中均匀地分布，显示出精细的网状结构，并和肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽标记)分布一致。表达flnb^g1586r突变蛋白的hek293细胞为表现出细胞形态的明显改变。然而，在表达flnb^l171r(与bd相关)突变蛋白的hek293细胞中，观察到flnb蛋白的球状聚集。

本申请中，wt：wildtype，野生型；bd：boomerangdysplasia，回飞镖样骨发育不良；ls：larsensyndrome，larsen综合征。以下不再重复描述。

根据本实施例的结果可以看出，与表达flnb^wt蛋白的atdc5细胞相比，表达flnb^l171r和flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞表现为明显的细胞形态改变。表达flnb^l171r蛋白的atdc5细胞表现为细胞体积的明显缩小，板状足(lamellipodia)消失，这可能归因于flnb^l171r与肌动蛋白的球形凝聚导致的肌动蛋白骨架的损坏。flnb蛋白第171位点的氨基酸处于肌动蛋白结合区域(abd)。通过体内(invivo)及体外(invitro)实验，已有研究表明flnb蛋白abd区域的错义突变导致flnb对肌动蛋白的结合力增强。肌动蛋白骨架蛋白对细胞结构提供机械性支撑，在维持细胞形态过程中起重要作用，对多数细胞的存活起着决定性作用。表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞在细胞形态上并未出现显著变化，说明其胞浆内的肌动蛋白结构改变不大。flnb蛋白第1586位点的氨基酸靠近hinge-1区域。细丝蛋白的hinge-1区域是一个具有一定柔韧性的结构域，连接细丝蛋白内两个重要的功能域，将其敲除可改变细丝蛋白的机械传感特性。表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞的形态学改变可能归因于hinge-1附近结构的性状改变，而不是因为flnb^g1586r蛋白和肌动蛋白之间亲和力的改变。前人的研究显示，flna蛋白中hinge-1下游的结构域涉及机械力学及信号传导的改变。因此，申请人认为flnb蛋白的hinge-1结构具有机械力学的特性，它的改变也能改变下游信号传导通路。

总之，flnb^l171r蛋白引起的肌动蛋白骨架改变和flnb^g1586r蛋白引起的下游信号传导通路的改变，都可能是导致软骨内成骨过程中细胞形态改变的原因，它们也可能导致细胞的迁移能力及凋亡率的改变。

实施例3转染后细胞凋亡及凋亡率统计

使用实施例1中转染48小时后的细胞，涡旋振荡5s，制备单细胞悬液，加入1mg/ml的hoechst试剂，维持37℃水浴7min，进行细胞核染色。随后冰上冷却单细胞悬液，并离心，弃除上清液后用pbs液将细胞沉淀重新吹散。将单细胞悬液配置于5mg/ml碘化丙啶(propidiumiodide，pi，china,best-reagentcompany)，维持37℃水浴7min，继续进行细胞核染色。随后冰上冷却单细胞悬液，并离心，弃除上清液后用pbs液将细胞沉淀重新吹散，在流式细胞仪(beckmancoulter(cytomicsfc500))上，捕获波长在400-500nm之间的蓝色荧光和波长为630nm的红色荧光。hoechst染色的细胞核代表早期凋亡的细胞，pi染色的细胞核代表晚期凋亡的细胞。

表达flnb^l171r突变蛋白(和bd相关)的atdc5细胞，与表达空载体(图4-a)、flnb^wt(图4-b)和flnb^g1586r突变蛋白(和ls相关)(图4-d)的atdc5细胞相比，表现为显著增高的凋亡率(图4-c)。

分别表达空载体(图5-a)、flnb^wt(图5-b)、flnb^l171r(与bd相关)(图5-c)和flnb^g1586r(与ls相关)(图5-d)的细胞的凋亡率之间并无明显差异。

flnbl^171r突变质粒转染的atdc5细胞凋亡率显著增高，无论是早期凋亡率还是晚期凋亡率都显著高于用空载体、flnb^wt和flnb^g1586r转染的atdc5细胞。另一方面，空载体、flnb^wt、flnb^l171r和flnb^g1586r任何一种转染的hek293细胞都未出现显著的凋亡率改变。(实验重复3次，p值根据每组数据和空载体的数据相比较计算(t检验))。

表1：分别用空载体、flnb^wt、flnb^l171r和flnb^g1586r质粒转染的atdc5细胞及hek293细胞的凋亡比例

所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p-值<0.001；**：p-值<0.01；*：p-value<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。

根据本发明的结果可以推断，ls和bd两种疾病之间的表型差异主要归因于软骨内成骨的软骨细胞的凋亡率差异。肌动蛋白骨架对细胞的存活起着决定性作用。表达flnb^l171r蛋白的atdc5细胞凋亡率显著增高，伴有肌动蛋白细胞骨架的损坏，而表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞的凋亡率无明显改变，与其胞浆内的肌动蛋白细胞骨架受到的影响较小相符合。申请人认为正是过度的细胞凋亡导致了flnb^l171r引起的bd患者出现长骨的缺失。在脊椎动物中，包括长骨和脊椎骨在内的骨骼生长发育通过软骨内成骨进行，而这一过程历经间充质干细胞的聚集到软骨细胞的分化及矿化。聚集的间充质干细胞可以分化为软骨细胞。一旦细胞外基质(ecm)出现矿化以及软骨细胞进入终末肥大期，软骨细胞即出现凋亡，软骨结构也转变为骨结构。在软骨内成骨的任何一个阶段，软骨细胞的凋亡收到干扰都会影响软骨内成骨。前人的研究显示在flnb双敲除(flnb^-/-)的小鼠中，软骨细胞的凋亡出现显著的增加，然而，这样的动物模型只是在模拟常染色体显性遗传的sct，表现出和bd相反的临床表型。未经诱导的atdc5细胞，在聚集之前具有间充质干细胞的特性。因此，表达flnb^l171r突变蛋白的atdc5细胞出现凋亡率显著增高的这一现象，使申请人有理由考虑bd患者出现的致死性骨骼发育低下或长骨的骨化中心缺失与软骨生长板中间充质干细胞的大量凋亡进而干扰骨化中心骨化有关。在表达flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中，并未观察到显著改变的细胞凋亡率。这一实验结果和flnb^g1586r相关的ls的临床表型相吻合，即ls患者的骨骼系统发育低下的严重程度远低于bd患者。

实施例4转染后细胞迁移及迁移率统计

使用实施例1中转染48小时后的细胞，消化细胞并制备单细胞悬液，离心后，弃除上清液，用pbs液重新吹散，选取其中40,000个(100μl)细胞添加到transwell(usa,corningcompany)的上室，添加600μl含有10％胎牛血清的dmem培养液到下室。37℃，5％co2环境下静置24小时后，用4％多聚甲醛固定细胞，并轻柔刮除上室细胞，对下室细胞进行dapi染色。荧光显微镜下，使用20×光镜对每个小室随机选取4个视野。使用image-j软件对每个视野进行细胞计数，每个小室重复三次实验，并用t-检验进行组间比较。

与表达空载体(图6-a)、flnb^wt(图6-b)和flnb^l171r(与bd相关)(图6-c)的atdc5细胞相比，表达flnb^g1586r突变蛋白(与ls相关)(图6-d)的atdc5细胞表现为细胞迁移能力的明显下降。

在转染空载体(图7-a)、flnb^wt(图7-b)、flnb^l171r(图7-c)(与bd相关)和flnb^g1586r(图7-d)(与ls相关)中任何一种的hek293细胞之间，并未出现细胞迁移能力的显著改变。

表2：分别用空载体、flnb^wt、flnb^l171r和flnb^g1586r质粒转染的atdc5细胞迁移能力的数据统计(以相同视野通过的细胞个数计算。实验重复3次，p值根据每组数据和空载体的数据相比较计算。(t检验))

所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p-值<0.001；**：p-值<0.01；*：p-value<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。

表3：分别用空载体、flnb^wt、flnb^l171r和flnb^g1586r质粒转染的hek293细胞迁移能力的数据统计(以相同视野通过的细胞个数计算。实验重复3次，p值根据每组数据和空载体的数据相比较计算。(t检验))

所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p-值<0.001；**：p-值<0.01；*：p-value<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。

实施例5检测骨化过程中的标志性分子

取部分实施例1中转染48小时后的细胞，使用westernblot技术(具体操作见实施例1)检测骨化过程中的标志性分子。

不同蛋白的表达水平以磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)作为内参。runx2的表达量在表达flnb^l171r和flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中都表现出明显升高(见图8-a和图8-b)。

磷酸化的smad3(磷酸化位点：t179和s423/s425)在表达flnb^l171r和flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中都有所升高，而smad3的表达量与表达flnb^wt的atdc5细胞中的smad3表达量无明显差异(见图8-a和图8-b)。

本实施例中，gapdh,glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，磷酸甘油醛脱氢酶。

本实施例的westernblot中使用的抗体：

一抗：anti-runx2(1:1000；catno.ab23981,abcam),anti-psmad3(磷酸化位点t179)(1:500；catno.ab193297,abcam),anti-psmad3(磷酸化位点：s423+s425)(1:1000；catno.ab52903,abcam),anti-smad3(1:3000；catno.ab75512,abcam),andanti-gapdh(1:1000；catno.sc-25778,santacruz)。

二抗：抗-兔igg(1:1000；catno.14708,cst)或抗-鼠igg(1:1000；catno.14079,cst)。

表4：分别用flnb^wt、flnb^l171r和flnb^g1586r质粒转染的atdc5细胞中，smad3、磷酸化smad3及runx2的表达量(通过imagej软件计算各条带的灰度值。实验重复3次，p值根据每组数据和空载体的数据相比较计算。(t检验))

所有数值和空载质粒(emptyvector)组相比。ns:无统计学差异(notsignificant)；***：p-值<0.001；**：p-值<0.01；*：p-value<0.05。误差线(errorbars)代表标准差(standarddeviation，sd)。

实施例6ls和bd病例的临床表型比较

一、外周血全基因组(wholeexome)dna提取

一个来我院就诊的8岁大ls男性患者被纳入本研究。通过对其本人及家庭成员的详细的问诊、体检及对可能存在骨骼与关节畸形的部位进行影像学检查。bd的发病率远远低于ls的发病率，且大部分bd患者在胎儿期及新生儿时期即已死亡。检索我院病例系统，未发现曾有bd的确诊病例，因而选择了与bd疾病相关且被报道次数最多的c.t512g(p.leu171arg)突变位点作为本申请研究的目标研究基因。

与患者及其家庭成员签署基因测序的知情同意书。用puregenebloodkit从患者及其父亲、母亲和姐姐的外周静脉血中提取样本。本研究获得了北京协和医院伦理委员会的审核批准。

使用puregenebloodkit试剂盒(gentrasystems,inc.,minneapolis,mn)从患者及其父亲、母亲和姐姐的外周静脉血中提取基因组dna。

(1)将1ml通过edta(0.01m，china,huameibioengineer)抗凝处理的血液中加入1mlcl细胞裂解液，轻柔地颠倒混匀6次，用3600rpm的转速离心5min，弃除上清液；

(2)像离心管中再次倒入1mlcl细胞裂解液，轻柔地颠倒混匀6次，用3600rpm的转速离心5min，弃除上清液；确保沉淀保留在管内的前提下，将离心管倒置在清洁的吸水纸上静置2min；

(3)配置蛋白酶k和缓冲液fg的混合液；

(4)加入500ul蛋白酶k和缓冲液fg的混合液，随即混匀至溶液无团块；

(5)65℃水浴30min，期间颠倒混匀数次；

(6)加入1ml异丙醇，随即颠倒混匀至出现簇状或丝状基因组dna；

(7)用3600rpm的转速离心8min，弃除上清液；确保沉淀保留在管内的前提下，将离心管倒置在清洁的吸水纸上静置2min；

(8)加入1ml70％乙醇，振荡5sec，用3600rpm的转速离心3min，弃除上清液；

(9)重复步骤(8)；

(10)确保沉淀保留在管内的前提下，将离心管倒置在清洁的吸水纸上静置5min；

(11)常温状态下，空气干燥基因组dna沉淀至所有液体完全挥发(至少5min)

振荡5sec,用3600rpm的转速离心3min，弃除上清液；

(12)加入200μltb缓冲液，低速涡旋振荡5sec，65℃水浴加热1h，期间轻弹助溶数次；

(13)使用nanodropnd8000(thermo，usa)鉴定所提取的基因组dna浓度和纯度。浓度＞30ng/μl，1.8＜od260/od280＜2.0，且总量＞3μg的基因组dna样本视为合格，保存于-80℃的冰箱备用；

二、全外显子组测序及sanger测序分析

1、全外显子组测序：

将基因组dna送至明码科技公司进行全外显子测序，采用安捷伦sureselecthumanallexonv5试剂盒、illuminatruseqrapidpecluster和sbs试剂盒进行全外显子区域捕获，并通过illuminahiseq2000/2500平台(illumina,sandiego,ca)进行测序。

2、数据二级分析流程：

(1)读句通过bwa软件(version：0.7.5a-r405)与ucschg19(ucschumangenomereferenceassembly19)参考基因组进行比对；

(2)比对结果合并到一个ban文件，并采用picard(version：1.55)软件去除pcr重复序列，随后进行下游数据分析；

(3)采用gatk软件(version：v2.3-9)进行变异读取；

(4)变异注释和筛选流程：采用明码科技公司(wuxinextcode)开发的流程进行注释变异。此外，从所有基因组测序中获得每个碱基的测序深度。采用vep软件(varianteffectpredictor，ensembl73)对变异进行注释。其中，功能性的编码区及剪接位点的变异将进入下一步分析，主要包括非移码的缺失/插入、错义突变及功能缺失型变异(获得终止密码子的突变、移码突变和关键剪接位点突变)。使用clinvar、omin和hgmd等三个主要收录已知或疑似致病突变的数据库，以筛选已知的致病突变；同时采取多种工具预测错义突变的功能及非编码调控序列的注释；使用千人基因组测序计划、外显子测序数据集合协作组、外显子组测序计划、荷兰及东京等五个基于人群的大规模测序数据库，以排除在正常人群中具有较高频率的变异。

测序结果解读：使用明码科技公司开发和验证的临床序列分析软件评估每个测序结果中的变异，并依据美国医学遗传学与基因组学学会发布的《序列变异解读标准和指南》对每个变异进行分类。测序变异使用hgvs命名法。

3、致病性评估:

(1)评估新发变异(denovovarients)的致病性：筛选功能性的编码区及剪接位点的变异，主要包括非移码的缺失/插入、错义突变及功能缺失型变异(获得终止密码子的突变、移码突变和关键剪接位点突变)等；在exac中，1000g和esp6500数据库中不能存在频率或突变位点个数(allelecount)小于4；通过igv或pileup初步判断新发突变的真实性；在sift、mutationtaster及polyphen2软件中评估突变位点的致病性，三个软件均为高致病性的变异视为致病性突变位点；使用alamut软件评估突变位点在不同物种中的保守性。

(2)评估纯合变异(homozygousvariants)和复合杂合变异(compoundheterozygousvariants)的致病性。

通过igv或pileup判断是否存在复合杂合变异。

在1000g、exac和esp6500数据库中频率小于0.3％且不存在纯合突变位点。

在mutationtaster、polyphen2和sift软件中评估变异位点的致病性，三个软件均为高致病性的变异视为致病性突变位点；

使用alamut软件评估突变位点在不同物种中的保守性。

在genecards、pubmed和omin公共数据库中对所有筛选出的高致病性突变进行文献回顾和功能检索，明确变异是否复合遗传模型。

4、sanger测序法验证全外显子组测序结果。

(1)引物设计

1)将flnb基因的碱基序列导入primer5软件，在验证位点的上下游50bp范围内设计引物；

2)选择最佳引物进行后续pcr验证；

(2)pcr扩增

pcr反应体系：

根据上述pcr反应体系，将配好的混合体系分装至96孔板中，移液，小心覆盖封板膜，防止在pcr过程中出现蒸发；按照下表设置pcr反应程序。

pcr反应程序：

反应结束后，配置1％琼脂糖凝胶，吸取2ul缓冲液+1ulpcr产物，在电压110v、电流75ma的条件下电泳40分钟。随后在紫外灯下观测pcr扩增结果。如条带清晰，且片段大小与预期相符，视为合格并进行sanger测序。

(3)sanger测序

pcr产物送北京华大基因公司进行纯化及sanger测序。

(4)测序峰图解读

使用codoncodealigner8.0.1软件解读sanger测序序列。

三、临床表型比较

纳入本研究的ls病例的8岁男孩，体格检查显示其具有典型的面部畸形(眼距增宽和鼻梁塌陷)、左侧斜颈、拇指和踇趾远端指节增宽、双侧肘关节内翻畸形。其家族史显示父亲、叔叔,祖父及曾祖父都表现为类似于患者上述的特征性面部畸形、拇指和踇趾远端指节增宽、双侧肘关节内翻畸形。患者的手和腕关节x片显示腕骨骨化中心增多及双侧拇指远端指节增宽。全脊柱正侧位片显示从第2到第6颈椎存在60°后凸畸形，并存在严重的脊柱侧凸畸形，上胸弯cobb角85°，主胸弯cobb角125°。我们对患者、患者父亲、母亲及其姐姐进行全外显子组测序，在患者及其父亲dna样本中检测到一个flnb基因错义突变位点(nm_001457.3,c.4756g>a(p.gly1586arg))且和larsen综合征的表型呈显性共分离，进一步的sanger测序法验证了这一突变位点。申请人使用了三个突变有害性预测工具，分析该突变的有害性，得出结果为：sift得出该突变为“tolerated”(sift评分0.46)，mutationtaster得出该突变为“diseasecausing”(p值为0.9999)；polyphen-2得出该突变为“probablydamaging”(评分为1.000)。flnb的1586位氨基酸在物种间具有很强的保守性。结合临床及基因层面的表现，我们明确了患者的larsen综合征的诊断。除了本研究报道的ls病例之外，另外一个前人报道具有相同突变位点的ls病例也被纳入对比研究(见表5)。

表5中，病例1是本研究报道的ls家系中的先证者，与其相同的突变位点在前人报道的病例2中检测确定(病例2见krakowd,robertsonsp,kinglm,morgant,sebaldet,bertolottoc,wachsmann-hogius,acunad,shapiross,takafutat,aftimoss,kimca,firthh,steinerce,cormier-dairev,superti-furgaa,bonafel,grahamjm,jr.,grixa,bacinoca,allansonj,bialermg,lachmanrs,rimoindlandcohndh.mutationsinthegeneencodingfilaminbdisruptvertebralsegmentation,jointformationandskeletogenesis.natgenet2004；36:405-410.)。病例3是一个前人报道的bd病例，是一个已死亡的男性早产胎儿(病例3见bicknellls,morgant,bonafel,wesselsmw,bialermg,willemspj,cohndh,krakowdandrobertsonsp.mutationsinflnbcauseboomerangdysplasia.jmedgenet2005；42:e43.)。

本实施例中，+，阳性；-，阴性。

表5病例1-3的疾病表型统计

结合实施例1至实施例6的结果可以看出，不同位点的flnb突变蛋白导致ls疾病中的骨化中心增多与bd疾病中骨化中心减少这两种截然相反的表型的分子生物学机制，可能通过软骨内成骨起始期的间充质干细胞凋亡、迁移及runx2蛋白的表达变化之间的相互制衡实现。runx2，曾被称为core-bindingfactor(cbf)，在骨形成过程中发挥重要作用。在ls中，runx2的增高可能促进间充质干细胞的聚集，而细胞迁移能力的下降与增高的细胞聚集可一起导致骨化中心的增多。在bd中，虽然runx2的表达也出现增高，但更为显著的细胞凋亡率抑制了runx2对细胞聚集的促进作用，因此导致了骨化中心的减少甚至缺失。

根据已有研究，对于正常的细胞，smad3可以和flnb蛋白相结合，进而flnb蛋白阻止smad3蛋白的磷酸化。然而，游离性smad3蛋白可以被磷酸化，更多的磷酸化smad3蛋白可进入细胞核，和hdac4蛋白及runx2形成蛋白复合体。在这种情况下，runx2的活性被hdac4蛋白所抑制。在申请人的研究中，磷酸化smad3的表达量明显升高，而smad3蛋白总量维持正常水平。这表明，尽管runx2的表达量升高，其活性仍可能被增多的磷酸化smad3蛋白所抑制，进而导致软骨内成骨过程受到抑制。

另一方面，现有研究中，当atdc5细胞聚集成软骨结节时，在整个聚集过程直至软骨细胞成熟的终末段，runx2的表达量始终维持较高水平；而当显性失活(dominantnegative)的runx2被导入细胞内，未分化atdc5细胞的聚集和继发的一系列增殖分化过程都受到了抑制。现有研究还发现bmp-4蛋白可通过提高runx2的表达量，补救这一抑制现象。由此可见，runx2在软骨形成的调节中发挥重要作用。

更进一步，细胞凋亡率可能和其他下游的分子信号通路产生交互作用，进而导致ls和bd患者中更为复杂的临床表型。本申请中runx2的表达量在表达flnb^l171r及flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中表现为上调趋势，这和前人报道的runx2能够增强软骨内成骨的结论相互矛盾。另有报道显示，在胞浆中和smad3结合的flnb蛋白数量减少，可增加游离smad3的磷酸化，进而磷酸化的smad3通过竞争runx2的抑制位点，从而导致细胞核内runx2的活性增加。在本申请中，atdc5细胞中runx2和磷酸化smad3的表达量增加提示flnb^l171r和flnb^g1586r可能减少了与smad3的结合。runx2表达量减少可通过pi3k-akt途径抑制atdc5细胞的聚集，反过来看，在表达flnb^l171r和flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中，runx2的表达量增加，可能增加了atdc5的聚集作用。从这一点考虑，表达flnb^g1586r突变蛋白的ls患者中腕骨、跗骨骨化中心增多，可能由胚胎发育期，软骨内成骨过程中间充质干细胞的聚集增强导致。另一方面看，表达flnb^l171r突变蛋白的bd患者中存在长骨骨化中心的缺失，与表达flnb^g1586r突变蛋白的ls患者中腕骨、跗骨骨化中心增多的现象相反，可能因为显著的细胞凋亡抵消了runx2对间充质干细胞聚集的促进作用。

已有研究表明，runx2蛋白的表达增多，还可以通过pi3k-akt突进促进atdc5细胞的迁移能力。这个结论和本申请中观察到的表达flnb^g1586r蛋白的atdc5细胞迁移能力下降的现象相违背。申请人认为在flnb突变蛋白对atdc5细胞迁移能力的下调作用和runx2对atdc5细胞迁移能力的上调作用之间存在一个平衡。肌动蛋白细胞骨架在细胞迁移中起着关键作用。在表达flnb^g1586r突变蛋白的atdc5细胞中，受到突变蛋白flnb^g1586r影响的肌动蛋白很可能某种程度上损害了细胞迁移能力，而此种程度可能超过了runx2对细胞迁移能力的上调作用，因为flnb蛋白更直接地作用于肌动蛋白骨架。虽然flnb^l171r突变蛋白也可以降低atdc5细胞的迁移能力，这一抑制作用可能被runx2对细胞迁移能力的提升效应所抵消，因为共聚焦显微镜显示大多数flnb^l171r蛋白和肌动蛋白异常结合并在胞浆中聚集，导致flnb^l171r对细胞迁移能力的直接影响减弱。此外，在ls患者中存在腕骨、跗骨骨化中心增多和部分骨骼的骨化中心发育低下之间相互违背的临床表型，这种现象提示了细胞迁移能力下降和软骨内成骨起始阶段间充质干细胞聚集增加之间的交互作用导致了更为复杂的临床表型。

综上，通过本申请的细胞模型可以模拟bd和ls两种疾病的软骨内成骨过程的起始阶段，并展现出了与常用的hek293细胞不同的骨组织的特异性变化，通过这些变化申请人结合现有研究可以推敲flnb基因错义突变对骨骼发育过程造成影响的深层次原因和机理，为进一步研究相关骨骼畸形疾病及相关疾病的预防和治疗提供了基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>表达错义突变的flnb基因的细胞模型、构建方法与应用

<130>p18019

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acaagactaggcgctatatgattggagtcacc32

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atagcgcctagtcttgtcggggatgtaggtga32

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aagacggcaaagcccggggagccctggtagacagct36

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccgggctttgccgtcttgccagttctggttaa32

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gctggggacactattcctaaga22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccctgttttccagcccattgag22