一种使精原干细胞高效向神经细胞分化的培养体系和方法与流程

本发明属于细胞生物学研究技术领域，涉及精原干细胞向神经细胞分化的方法，可应用于神经细胞分化及神经组织损伤修复在临床医学应用方面的研究。

背景技术：

目前只有啮齿动物精原干细胞(spermatogonialstemcells,sscs)获得了体外长期培养，人和其他物种干细胞仍不能长期培养，所以小鼠sscs成为通用的细胞模型使用。

精原干细胞和神经干细胞(neuralstemcells,nscs)存在着紧密的联系，具有很多相似的干细胞特征。首先，胶质细胞源性的神经营养因子(gdnf)是sscs维持自我更新最关键的信号因子，而nscs维持体外增殖的重要因子是脑源神经营养因子(bdnf)；其次，研究还发现基质源细胞因子(cxcl12)在sscs和nscs自我更新调控中都发挥着重要作用；再次，表皮生长因子(egf)和碱性成纤维生长因子(bfgf)也能促进两类干细胞增殖；此外，神经细胞添加剂(b27)和n2对于nscs增殖和分化调控具有重要的作用，随后在体外培养sscs中也通常添加两类添加剂，这对于sscs体外维持自我更新也具有重要促进作用。两类干细胞展现出诸多相似的生物学特征，显示sscs有可能是神经细胞分化的一种更好的细胞来源，但先前多使用多功能干细胞和间充质干细胞诱导神经细胞分化，作为神经修复的细胞来源。

nscs具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，是神经系统疾病治疗的潜在细胞。但是nscs分化的调控机制研究还并不透彻。

以往研究显示诱导多能干细胞向神经细胞分化，需要添加神经因子b27和n2两种试剂进行诱导，但存在诱导分化效率低和不彻底性等问题；在中，体外促进小鼠sscs增殖的培养体系中，会添加b27和n2两种试剂，对于小鼠sscs增殖有重要的促进的作用；由此看出，sscs体外培养体系和神经细胞诱导的体系非常接近，sscs有可能成为替代nscs较为理想的成体干细胞。但以往的研究并没有建立高效诱导精原细胞向神经分化的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种培养体系，该培养体系可以使精原干细胞(sscs)高效向神经细胞分化。

本发明还提供了精原干细胞(sscs)高效向神经细胞分化的方法。

本发明的目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了一种使sscs向神经细胞分化的培养体系，该培养体系无饲养层，无生长因子，且含有l-谷氨酰胺、神经因子b27和n2。

本发明首次发现了，sscs在特定的培养体系中，可分化为神经细胞，这个技术可能应用到临床中去解决一些神经性疾病的难题，sscs有可能成为神经性疾病治疗的新的种子细胞。

在现有技术中，sscs的培养，一般是建立在有饲养层的基础上促进其体外增殖。但本发明研究发现无饲养层条件下可以更好的促进sscs向神经分化，在存在饲养层条件下，未发现sscs向神经细胞分化。

此外，现有的sscs培养体系，一般含有生长因子，以促进sscs增殖，而对于本发明来说，生长因子的存在会影响sscs向神经细胞分化，因此，无生长因子也是必须的。

进一步地，在所述的培养体系中，l-谷氨酰胺、b27和n2的在体系中的体积分数分别为0.8～1.2％、1～3％、0.8～1.2％。作为优选的实施实施方式，l-谷氨酰胺、b27和n2的在体系中的体积分数分别为1％、2％、1％。

作为优选的实施方式，本发明的培养体系中，含有以下组分：

作为更优选的实施方式，所述的培养体系中，含有以下组分：

本发明中，所述的b27是一种神经类细胞的营养混合物，含有20多种物质，对nscs和sscs有促进增殖的作用。

所述的n2为腐胺，黄体酮，转铁蛋白，胰岛素和亚硒酸盐的混合物。

所述的stro-34培养基为造血干细胞专用培养基，可支持sscs体外增殖。

上述的物质均可以商业购买，其成分确定的。

另一方面，本发明还提供了一种使精原干细胞向神经细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：包含以下步骤：

(1)采用多聚赖氨酸处理培养器皿；

(2)接种精原干细胞(sscs)；

(3)培养。

具体地，步骤(1)中，采用多聚赖氨酸处理培养皿：配置0.01～0.05％的多聚赖氨酸加入到培养器皿，要求没过培养器皿，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体，pbs磷酸缓冲液液轻轻洗涤2-3次，放入培养箱，待接入细胞。

步骤(2)中，接种精原干细胞：将培养好的精原干细胞单细胞悬液，细胞密度为0.8～1.2×10⁵个/ml，接入到处理好的培养器皿。

步骤(3)中，应用上述配制的神经诱导培养基进行细胞培养，培养条件是5％co2和37±1℃，22～26h后采用半量换液，继续培养5～7天，即可以获得生殖干细胞分化的神经细胞。

作为优选的实施方式，步骤(1)中，采用0.01％的多聚赖氨酸处理培养器皿。

作为优选的实施方式，本发明中的培养体系和方法，所适用的精原干细胞为小鼠精原干细胞，当然，其也可以适用于其他的物种的精原干细胞，(如人和猪精原干细胞)精原干细胞是一类保守的干细胞，根据以往研究发现，不同物种之间精原干细胞基因表达和生物学性质上无本质差别，故本方法也可以适用于其他物种精原干细胞诱导神经分化的研究应用，特别可以尝试应用到人类的精原干细胞中，这样可以为神经损伤病人提供另一种高效干细胞修复方案。

本发明的有益效果：

1、本发明的发明人发现在存在饲养层条件下，未发现sscs向神经细胞分化，诱导神经细胞分化体系，结合sscs和nscs生物学性质，通过实验探索和不断改进方案，最终建立起一种诱导小鼠sscs高效向神经细胞分化的无饲养层培养的培养液，该培养液只是在sscs培养体系基础上去除了生长因子，多添加了n2试剂(该试剂在该培养液中主要的作用是促进向神经细胞分化)；在这个培养液下小鼠sscs高效快速和彻底地向神经细胞分化，这说明sscs可能是替代nscs的神经细胞更好的修复替代细胞；

2、本发明建立的诱导小鼠sscs向神经细胞分化的方法，需要时间短，大约一周时间就可以出现典型神经元细胞和胶质细胞，本发明方法适合流程化操作、重复性高、成功率高、操作简单，无需特殊化条件就能达到效果，可极大的节省时间和试验材料，对比以往建立干细胞诱导神经细胞的方法具有明显优势；

3、本发明的方法在神经细胞分化与获得，以及神经系统疾病修复等方面具有潜在应用价值，本发明方法可以应用到临床中去解决一些神经性疾病的难题，sscs有可能成为神经性疾病治疗的新的种子细胞。

附图说明

图1为小鼠sscs向神经细胞分化的结果技术路线图。

图2为小鼠sscs向神经细胞分化过程；其中，a：无饲养层培养的小鼠sscs；b，c和d：小鼠sscs向神经细胞诱导第3，4和5d；e：诱导神经细胞第6d，出现了神经突触；f和g：诱导第6d和7d，出现大量典型神经细胞和神经元；h：饲养层培养下小鼠sscs诱导未出现明显分化，无神经细胞产生。

图3为小鼠escs(小鼠胚胎干细胞)向神经分化诱导过程；其中a：新接种escs；b、c、d、e和f：分别为诱导神经分化第2、3、4、5和6天；g：nestin免疫荧光染色；h：无诱导的escs。在这个培养过程中，escs出现了神经分化，但各个时期仍存在escs残留，分化不完全，总体效率低于sscs。

图4为小鼠sscs蛋白检测及分化过程分析；其中，a，b和c：出生7d龄睾丸切片vasa染色，分别为染核，蛋白染色和merge结果；d，e和f：小鼠sscsvasa蛋白免疫荧光染色；分别为染核，蛋白染色和merge结果；g，h和i：小鼠sscs诱导神经细胞的第4，5和6d表达膜蛋白vasa细胞比例分析。

图5为分化的神经细胞免疫荧光染色图；其中，a和b：小鼠sscs诱导神经细胞nestin，tuj1免疫荧光检测；c：对照组。

图6小鼠sscs诱导的神经细胞基因表达rt-pcr检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

原料来源：

实施例1一种诱导sscs向神经细胞分化的培养体系

本实施例的诱导精原干细胞向神经细胞分化的培养液，以体积百分比计算，包括以下组分：

实施例2一种诱导sscs向神经细胞分化的培养体系

本实施例的诱导精原干细胞向神经细胞分化的培养液，以体积百分比计算，包括以下组分：

实施例3一种诱导sscs向神经细胞分化的培养体系

本实施例的诱导精原干细胞向神经细胞分化的培养液，以体积百分比计算，包括以下组分：

实施例4sscs向神经细胞分化的过程

诱导sscs向神经细胞分化

步骤(1)中，采用多聚赖氨酸处理培养皿：配置0.01％的多聚赖氨酸加入到培养器皿，要求没过培养器皿，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体，pbs磷酸缓冲液液轻轻洗涤2次，放入培养箱，待接入细胞。

步骤(2)中，接种小鼠精原干细胞：将培养好的小鼠精原干细胞单细胞悬液，细胞密度为0.8～1.2×10⁵个/ml，接入到处理好的培养器皿。

步骤(3)中，应用实施例1配制的神经诱导培养基进行细胞培养，培养条件是5％co2和37±1℃，22～26h后采用半量换液，继续培养5～7天，即可以获得精原干细胞分化的神经细胞。

在无mef饲养层的条件中，小鼠sscs可以长期维持体外增殖(如图2a)；但是在其培养液中去除生长因子如(如gdnf，egf，bfgf和lif等)以后，sscs可以快速高效的向神经细胞分化，培养至第3d时，细胞折光性下降，开始变形(如图2b)；培养第4d，小鼠sscs伸出伪足，不在呈现干细胞克隆集落生长，贴壁性能也增强(如图2c)；培养第5d圆形的sscs形态基本消失，都是成纤维状的细胞(如图2d)；培养第6d已经能看到很多类似神经元和胶质细胞的形态细胞(如图2e)；培养到第7d可以清晰的看到典型神经元和大量突触出现(如图2f和2g)；表明本发明的培养体系可以促进小鼠sscs向神经细胞分化。表明本发明的培养体系可以促进小鼠sscs向神经细胞分化。

对照组应用饲养层培养，培养体系和试验组相同。对照组细胞培养在饲养层上，并没有发现有明显的神经类细胞产生，但小鼠sscs停止生长，数量减少(如图2h)。

对比例1escs(胚胎干细胞)向神经细胞诱导的过程

实验方法：请补充具体的实验方法，如某些步骤与实施例4相同，可以写“培养体系和培养方法同实施例1，除sscs替换为escs。

实验结果：如图3所示，其中图3a为新接种escs；图3b、c、d、e和f分别为诱导神经分化第2、3、4、5和6天；图3g为nestin免疫荧光染色；图3h为无诱导的escs。由图3可知，在这个培养过程中，escs出现了神经分化，但各个时期仍存在escs残留，分化不完全，总体效率低于sscs。虽然escs为多能干细胞，但是，即便是采用本发明中的培养体系和方法，其分化效率却不如sscs，同时分化存在不彻底性，多能干细胞大量残留。表明本发明的培养体系和方法对sscs具有更好的适用性。

实施例5sscs向神经细胞分化过程检测

为了检测小鼠sscs向神经细胞分化过程，选用了生殖细胞最重要的膜表面特异性标记vasa进行分析。通过7日龄小鼠睾丸组织免疫荧光染色，显示vasa特异性的表达在生精小管内侧的小鼠sscs膜表面(如图4a，4b和4c)，是生殖细胞特异性的标志蛋白；对体外无饲养层条件下培养的小鼠sscs进行免疫荧光染色，结果显示vasa特异的表达在小鼠sscs膜表面(如图4d，4e和4f)，证实了vasa蛋白的忠实性。

实验方法如下：

1.石蜡切片制备

1)取材：将新取的7d龄小鼠睾丸组织，去掉外部脂肪和附睾后，沿横轴切开，使组织块厚约0.5mm；浸入到4％多聚甲醛中固定24h；

2)修块：把已固定组织修至所需大小，力求小而薄；

3)冲水：把已经修好的块状的组织放入流水中冲洗24h，把固定液洗干净；

4)脱水：50％乙醇+20％正丁醇+30％水，6h；50％乙醇+35％正丁醇+15％水，4h；45％乙醇+45％正丁醇+10％水，3h；40％乙醇+55％正丁醇+5％水，3h；25％乙醇+75％正丁醇，2h；5％乙醇+95％正丁醇，2h；100％正丁醇(i)，5h；100％正丁醇(ii)，3h；二甲苯，10mim；软蜡(i)：15min；软蜡(ii)：20min；75％乙醇12h，80％乙醇2h，90％乙醇1h，95％乙醇两次，每次40min，100％乙醇两次，每次30min，两次，每次30min。软蜡30min，硬蜡30min。

5)包埋：把已经脱水完全的组织样品包埋到石蜡块里；

6)切块：厚度3～5μm的超薄切片，切好后铺到玻片上烤干待用；

2组织免疫荧光

1)石蜡组织切片常规脱蜡，经梯度酒精入水；

2)ph6.0枸橼酸缓冲液微波加热抗原修复15min；pbs洗三次，每次5min；

3)3％h2o2封闭组织内的过氧化物酶15min；pbs洗三次，每次5min；

4)加入1％bsa(10％山羊血清)封闭30min(封闭完不用洗)；

5)加入相应的1％bsa稀释的一抗(鼠源vasaabcam-ab13840；兔源nestin；millipore；鼠源tuj1，sigma)，置于4℃过夜，pbs洗3次，每次5min；

6)加入相应的1％bsa稀释的二抗(绿光抗鼠二抗goatanti-mouseiggalexa488，invitrogen-a11001；红光抗鼠二抗donkeyanti-mouseiggalexa568，invitrogen-a10037；红光抗兔二抗goatanti-rabbitiggalexa568，invitrogen-a11036)，置于37℃反应1h，pbs洗3次，每次5min；

7)加入终浓度为10μg/ml的hochest33342(molecularprobes公司)对细胞核染色5～10min，pbs洗3次，每次3min；

8)抗淬灭剂封片，拍照。

3细胞免疫荧光检测

1)在24孔板中接种小鼠sscs进行无饲养层培养(培养体系和方法见实施例1，进行细胞免疫荧光检测；

2)用4％多聚甲醛固定细胞10～30min后，pbs洗3次，每次3min；

3)加入0.5％triton穿孔破膜处理10min，pbs洗3次，每次3min；

4)加入1％bsa(10％山羊血清)封闭30min(封闭完不用洗)；

5)加入相应的1％bsa稀释的一抗(鼠源vasaabcam-ab13840；兔源nestin；millipore；鼠源tuj1，sigma)，置于4℃过夜，pbs洗3次，每次5min；

6)加入相应的1％bsa稀释的二抗(绿光抗鼠二抗goatanti-mouseiggalexa488，invitrogen-a11001；红光抗鼠二抗donkeyanti-mouseiggalexa568，invitrogen-a10037；红光抗兔二抗goatanti-rabbitiggalexa568，invitrogen-a11036)，置于37℃反应1h，pbs洗3次，每次5min；

7)加入终浓度为10μg/ml的hochest33342(molecularprobes公司)对细胞核染色5～10min，pbs洗3次，每次3min；

8)抗淬灭剂封片，拍照。

4细胞纯度检测

1)收集诱导第4，5和6d神经细胞到15ml离心管中，178g离心3min，去上清，并同等设置对照组；

2)加入4％多聚甲醛固定10～30min后，178g离心3min，pbs洗3次；

3)加入0.5％triton-100穿孔破膜处理10min，178g离心3min，pbs洗3次；

4)加入1％bsa(10％山羊血清)封闭30min；

5)加入鼠源一抗vasa(abcam-ab13840)，置于4℃30～60min孵育(对照组加入鼠igg)；后用pbs洗涤3次，每次5min；

6)试验组和对照组同时加入1％bsa稀释的绿光二抗(goatanti-mouseiggalexa488，invitrogen-a11001)，置于37℃反应1h，pbs洗3次，每次5min；

7)流式细胞仪上机检测。

实验结果：通过7日龄小鼠睾丸组织免疫荧光染色，显示vasa特异性的表达在生精小管内侧的小鼠sscs膜表面(如图4a，4b和4c)，是生殖细胞特异性的标志蛋白；对体外无饲养层条件下培养的小鼠sscs进行免疫荧光染色，结果显示vasa特异的表达在小鼠sscs膜表面(如图4d，4e和4f)，证实了vasa蛋白的忠实性；接下来对小鼠sscs诱导的神经细胞的第4，5和6d进行细胞染色，通过流式细胞技术分析这个过程中表达vasa细胞的比例，证明精原细胞存在比例，结果显示在诱导后的，4，5和6d表达vasa细胞比例依次为77.2％；37.3％和0.4％(如图4g，4h和4i)，在诱导第4d开始，有大量的sscs开始分化，在诱导第6d以后基本上不存在未分化的sscs，证明本发明专利建立的方法诱导效果高，彻底。

实施例6诱导神经细胞的免疫荧光检测

实验方法：对培养的小鼠sscs诱导的神经细胞进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法同实施例5中记载。

实验结果：培养的小鼠sscs诱导的神经细胞进行免疫荧光检测，特异性的神经元标志蛋白巢蛋白nestin和微管蛋白tuj1进行检测，结果显示小鼠sscs诱导的神经细胞中存在表达nestin的阳性细胞(如图5a)和tuj1阳性细胞(如图5b)，阴性对照组为阴性(如图5c)，这说明小鼠sscs已经成功的分化为神经细胞。

实施例7诱导神经细胞基因表达分析

为确定sscs诱导的细胞为神经细胞，在这里检测了神经元标志基因(nestin，map-2和neurotensin)，其中也表达少突胶质细胞和星型胶质细胞标志基因galc和gfap。

1细胞总rna的提取(qiagen微量抽提试剂盒)

1)微量样品，加入新配好的裂解液80μl(裂解液：1ml的bufferrlt中含10μl巯基乙醇，使用前配制)；

2)加入80μl70％的乙醇，用枪头混匀，不要离心；

3)将样品转移至试剂盒中提供的spincolumn中，装配2ml收集管，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃去穿透液，放回收集管；

4)加入350μlbufferrw1，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液，放回收集管；

5)将80μldnaseⅰ直接滴到硅质膜上，室温静置15min，务必直接全部滴上，否则dna会消化不完全；

6)加入350μlbufferrw1，8000g离心15s，弃穿透液及收集管；

7)更换新的2ml收集管，加入500μlbufferrpe(已按要求加入了无水乙醇)，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液；

8)加入500μlbufferrpe，轻轻盖上盖子，8000g离心2min，彻底去除乙醇，弃穿透液及收集管，取下spincolumn时避免接触到穿透液，乙醇会影响回收；

9)将spincolumn移至新的2ml收集管，并开盖做高速离心2min，弃穿透液和收集管。更换新的1.5ml收集管，直接滴加20～40μlrnase-freewater在膜中心，最高转速离心2min。重复洗脱一次可增加回收量，-80℃保存或立即合成cdna。

2总rna浓度测定

2％琼脂糖凝胶电泳跑rna样品检测rna是否降解，nanodrop2000检测rna的浓度及纯度，纯度控制在od260/od280为1.8～2.0之间，根据rna浓度计算出样本rna调至1μg的体积。

3合成cdna

逆转录检测1ststrandcdnasynthesis采用二步法，第一步：反应体系：样本rna1μg，random6mersprimer1μl，dntp1μl，蒸馏水配平至10μl，反应条件为：65℃5min，冰上急冷；第二步：反应体系：将第一步变性、退火后反应液10μl，5×primescripttmbuffer4μl，rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl，primescripttmrnase(200u/ul)1μl，蒸馏水4.5μl，总体系20μl，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃1h。

4rt-pcr

20μlpcr体系：2×primestarbuffer/premix10μl；上游引物f0.2μl；下游引物r0.2μl；模板1μl和ddh2o8.6μl；反应程序为：预变性95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，循环35个；最后总延伸72℃7min。体系中所用引物下表1。

表1pcr检测引物表

实验结果：rt-pcr结果显示(见图6)，

rt-pcr结果显示，诱导神经细胞表达神经元标志基因(nestin，map-2和neurotensin)，其中也表达少突胶质细胞和星型胶质细胞标志基因galc和gfap，证明了小鼠sscs成功地诱导产生了神经细胞。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>佛山科学技术学院

<120>一种使精原干细胞高效向神经细胞分化的培养体系和方法

<141>2018-07-26

<160>12

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