本发明涉及一种外泌体分泌的方法，特别涉及一种提高间充质干细胞分泌外泌体产量的方法。(二)
背景技术：
：目前心肌梗死的发病率逐年升高，因其会导致心肌细胞不可逆的损伤和缺失，以及引起瘢痕形成，造成严重的心室重构，出现一系列的并发症，最终可发展为心力衰竭，成为心血管疾病中的主要致死原因。因此促进心肌细胞再生，挽救濒危心肌成为心肌梗死后再生修复的中心环节。尽管有多种缓解心脏损伤的治疗方法，但救治效率仍不够高，未能明显改善患者心肌梗死后的不良后果，因此需要寻求新的方法来进行救治。当前的细胞移植疗法可促进梗死局部血管新生和心肌再生，进而改善心肌梗死后的心功能，而且其在心血管病治疗上的安全性和有效性已得到证实，为受损的心脏修复提供了巨大的希望，但其移植后的低生存率、低定植率、且难以向心血管细胞谱系分化等问题成为制约其疗效的关键因素，这就促使我们寻求更好的药物制剂来提升治疗效果，以及探索新的替代治疗方法来克服细胞治疗过程中的各类问题。现在有多项研究表明，细胞通常是通过旁分泌效应发挥作用的，其中外泌体是旁分泌分子中的重要成员之一，可以携带脂质、蛋白质、核酸等多种活性小分子物质，介导体内不同细胞类型之间的细胞间通讯，参与细胞之间的生物信号传递，以调节机体内多种病理生理过程，在癌症、感染性疾病及心血管系统疾病中都可以发挥重要作用，除此之外，外泌体还可作为疾病的生物标志物和预后因子，也可以被用作药物递送的载体用于临床。目前基于外泌体的无细胞替代疗法正在不断兴起，在心血管领域中外泌体也有其独特的疗效，它们能够在急性局部缺血和再灌注模型以及慢性缺血期间保护心脏，在心梗后的疾病转归过程中具有促进血管新生，减轻纤维化，减小梗死面积，抑制凋亡等重要生物学功能，最终可改善心梗预后。它不但具备了干细胞移植疗效，而且减低了细胞移植风险，如免疫排斥反应，致畸致瘤等，因此近年来外泌体在心血管领域得到了广泛的关注和研究，在心梗治疗方面有着广大的应用前景。但是间充质干细胞分泌外泌体的能力有限，大批量培养细胞也只能得到不多量的外泌体，在培养和提取过程需要大量人力物力财力，可能会减慢实验的研究进展，因此，优化干细胞培养体系提高外泌体的产量将有助于提高其未来的临床应用价值。(三)技术实现要素：本发明的目的是优化干细胞培养体系，提供一种提高间充质干细胞分泌外泌体产量的预处理方法，以增加外泌体的产量。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，所述方法为：将传代稳定的骨髓间充质干细胞接种至细胞体外培养基，先于缺氧环境中37℃培养24小时，再于常氧环境中37℃培养48小时，收取培养上清液通过超速离心法提取细胞分泌的外泌体。进一步，所述缺氧环境是在o2体积浓度0.5％，co2体积浓度5％(余量为氮气)的混合气体中进行。进一步，常氧环境是在co2体积浓度5％、氮气体积浓度95％的混合气体中进行。进一步，所述细胞体外培养基组成为：丙酮酸钠110mg/l，谷氨酰胺10-30mm(优选20mm)，胎牛血清10％，溶剂为低糖dmem培养基。进一步，培养上清液提取外泌体的方法为：(1)将培养上清液在4℃条件下，分别以300g、10min，2000g、20min，10000g、30min的转速和时间进行角转离心，以去除细胞碎片和大囊泡，获得上清液a和沉淀a；(2)再将上清液a转移至10kd浓缩管中，在4℃条件下，以4000g的转速多次水平离心10min，至上清液a浓缩到原体积的1/3-1/5倍，获得浓缩液；(3)将浓缩液在4℃条件下，以120000g转速水平离心70min，获得上清液b和沉淀b；(4)弃去上清液b，将沉淀b以120000g转速水平离心70min，获得沉淀c和上清液c，沉淀c即为外泌体。所述上清液a-上清液c，沉淀a-沉淀c中字母均无含义，只是为了区分不同步骤的产物。更优选，本发明所述提高间充质干细胞外泌体产量的方法按如下步骤进行：将传代稳定的骨髓间充质干细胞接种至细胞体外培养基，先于37℃、o2体积浓度0.5％、co2体积浓度5％(余量为氮气)的混合气体中培养24小时，再于37℃、co2体积浓度5％、氮气体积浓度95％的混合气体中培养48小时，收取培养上清液；将细胞培养上清液在4℃条件下，分别以300g、10min，2000g、20min，10000g、30min的转速和时间进行角转离心，以去除细胞碎片和大囊泡，获得上清液a和沉淀a；再将上清液a转移至10kd浓缩管中，在4℃条件下，以4000g的转速多次水平离心10min，至上清液a浓缩到原体积的1/3-1/5倍，获得浓缩液；将浓缩液在4℃条件下，以120000g转速水平离心70min，获得上清液b和沉淀b；弃去上清液b，将沉淀b以120000g转速水平离心70min，获得沉淀c和上清液c，沉淀c即为外泌体。本发明的有益效果主要体现在：本发明缺氧预处理间充质干细胞后，其分泌的外泌体产量明显增加，比常氧条件下提高了1.2-1.5倍，p＝0.011，具有统计学差异，因此更加有利于心血管疾病的治疗。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：1.msc细胞系常规培养于细胞体外培养基，添加100u/ml青霉素和100u/ml链霉素，一旦汇集，采用0.25％胰酶(w/v)-0.02％乙二胺四乙酸(edta)(w/v)(吉诺生物医药技术有限公司)消化传代。所述细胞体外培养基组成为：丙酮酸钠110mg/l，谷氨酰胺20mm，胎牛血清10％(体积浓度)，溶剂为低糖dmem培养基(购自美国bi公司)。2.待msc生长至70％-80％汇合度，在o2体积浓度0.5％，co2体积浓度5％(余量为氮气)的混合气体中37℃培养24小时后，去除细胞体外培养基，采用pbs洗涤3次，换成添加100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的无血清低糖dmem培养基，于37℃下、在co2体积浓度5％、氮气体积浓度95％的混合气体中，培养48小时。无血清低糖dmem培养基组成：丙酮酸钠110mg/l，谷氨酰胺20mm，溶剂为低糖dmem培养基(购自美国bi公司)。3.收取步骤2培养上清液约300ml于50ml离心管，在4℃条件下，分别以300g、10min，2000g、20min，10000g、30min的转速和时间进行角转离心，以去除细胞碎片和大囊泡，获得上清液a和沉淀a，再将上清液a转移到新的50ml离心管中。4.用10kd的浓缩管浓缩步骤3所收集的上清液a，在4℃条件下，以4000g的转速多次水平离心10min，将上清液a浓缩到原体积1/3-1/5倍后得到浓缩液，以便达到超速离心机的上机体积要求后，将浓缩液转移到六根超离管中，在4℃条件下，以120000g转速水平离心70min，获得上清液b和沉淀b。弃去上清液b，将各超离管中沉淀b汇集到一根超离管中，再以120000g转速水平离心70min，获得沉淀c和上清液c，沉淀c即为外泌体，用适当体积的pbs(优选200μl)重悬沉淀，转移到ep管中，通过bca蛋白定量法对(100ml)细胞上清分泌的外泌体产量进行定量，如不需立即使用则于-80℃保存，重复4次试验，结果见表1。同样条件下，设置对照组，跟实验组的区别是：37℃、co2体积浓度5％、氮气体积浓度95％的混合气体中培养48小时，不用在o2体积浓度0.5％条件下预处理。结论：缺氧预处理间充质干细胞可明显提高其分泌的外泌体产量。表1外泌体产量第一次试验(ug)第二次试验(ug)第三次试验(ug)第四次试验(ug)常氧组54.6142.9659.9455.72缺氧组76.026175.3274.45表2表1数据分析当前第1页12