一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法与流程

本发明属于精子细胞处理技术领域，具体涉及一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法。

背景技术：

精子细胞是一种单倍体细胞，属于睾丸生精细胞类型之一，在第二次减数分裂末期完成时产生。它是精子发生、成熟、形成功能性精子过程中第二次成熟分裂的结果，经过变形后形成精子。近年来，精子细胞显微注射授精技术已经成为辅助生殖的重要技术，高活率高纯度的精子细胞的获得在以后生殖医学的研究具有更广阔的前景。

目前常用的分离精子细胞的方法有密度梯度离心法和重力沉降法，但其步骤繁琐，对操作者经验要求较高，且分离得到的细胞纯度较低，分离的时间较长，细胞长时间处于非培养条件下，容易受到损伤。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供的一种操作简单、细胞纯度高的水牛精子细胞分离及相应的细胞鉴定方法。

具体技术方案是：一种水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法，其主要包括以下步骤：

1)获得水牛睾丸，用胶原酶iv、透明质酸酶和dnasei组合酶法消化，细胞筛过滤，差异贴壁后取悬浮细胞；

2)取悬浮细胞进行活细胞染色；

3)采用流式细胞仪根据细胞形态和染色情况进行分选，获得水牛精子细胞；

4)对获得水牛精子细胞进行鉴定。

优选的，水牛睾丸分离精子细胞及鉴定方法中步骤1)具体操作方法如下：

1)向装有组织的容器中加10倍体积的胶原酶iv溶液，37℃恒温摇床孵育15min；

2)加入适量透明质酸酶和dnasei，37℃恒温摇床孵育15min；

3)移液枪吹打组织至完全散开，无明显的组织块，离心弃上清，如此再重复2次；加入适量trypsin/edta、dnasei，37℃消化15min；

4)加入同体积含血清培养基终止消化，离心后重悬细胞，依次用200目细胞筛和300目细胞筛过滤；将细胞悬液转移到明胶覆盖的培养皿中，差异贴壁培养，收集悬液备用。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤1)涉及试剂浓度如下：

所述collagenaseiv浓度为2.5mg/ml，透明质酸酶浓度为10mg/ml，所述胰酶浓度为2.5mg/ml，dnasei浓度为5mg/ml，含血清培养基为含10％fbs的dmem/f12培养基，明胶浓度为1mg/ml。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤1)中细胞连续差异贴壁培养条件为：37℃，co2浓度为5.5％的培养箱中培养4至6小时，收集上层悬浮细胞，重悬培养4至6小时，重复三次。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤2)具体操作如下，采取的细胞染色液为hoechst33342，浓度5μg/ml；孵育条件为37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育60min，用40μm过滤筛过滤，置冰上送流式分选。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤3)具体操作如下，流式细胞仪选用70μm喷嘴，鞘液压力70psi；根据dna含量设门分选；分选中的前向散射光电压为150v，侧向散射光电压为245v，hoechst-blue通道的电压为230v；保持进样速率约为10000个/s，接收管中预先加入200μl培养液。

优选的，水牛睾丸精子细胞分离和鉴定方法步骤3)中流式细胞仪dna含量设门为：以二倍体体细胞为参照，划定单倍体细胞群进行设门

采用上述技术方案后，本发明有益效果为：

针对精子细胞分离困难的问题，发明人对分离水牛精子细胞方法进行改进研究。本技术方案建立了一种行之有效的水牛精子细胞分离方法，通过使用组合酶法分解水牛睾丸组织，得到单细胞悬液，采用连续差异贴壁法去除体细胞的干扰，再采用流式细胞仪根据未贴壁细胞染色后的荧光强弱判断细胞dna含量，有效去除了二倍体精原细胞和四倍体初级精母细胞等非目标细胞的干扰，实现大量单倍体精子细胞的成功分选。分选获得的精子细胞经鉴定，较纯且不含其它杂质细胞，鉴定效果较好。

在此基础上，发明人通过不断摸索和优化各种条件(消化时间、染色液浓度、流式细胞仪电压)，从而建立了一套水牛精子细胞分离方法，该法可获得纯度高、活率大的精子细胞。

附图说明

图1是差异贴壁后经过染色的生精细胞图。

a图：生精细胞的形态图，常光下观察；生精细胞包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子；

b图：hochest33342染细胞核效果图，荧光下观察；

c图：a图和b图的组合图像。

图2是流式细胞仪分选出的水牛精子细胞形态图。

a图：分选出的单倍体细胞形态图，常光下观察；

b图：分选出的细胞细胞核仍然显示蓝光，说明分选过程中hochest33342的荧光并未淬灭；

c图：a图和b图的组合图像。

图3是水牛精子细胞免疫荧光图。

a图：dapi染细胞核的效果图；

b图：以ddx4为maker的免疫荧光鉴定图；

c图：a图和b图的组合图像。

具体实施方式

下面结合附图1至3和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

实施例一：水牛精子细胞分离方法

(1)从屠宰场采集水牛睾丸，置于含有双抗的37℃的生理盐水中于3小时内运回实验室。

(2)将取回的睾丸在pbs中用镊子和手术剪刀剥去睾丸白膜及脂肪组织，露出白膜；选取无破损、无内出血的睾丸称重，75％酒精消毒10min，重复2次，转入超净台；

(3)将有白膜的睾丸放入500mlpbs的烧杯中清洗三遍；

(4)将睾丸放入装有100mldmem/f12的皿中，切开白膜，用尖头镊子将尽可能多的睾丸组织撕下来放入预先准备的含有dm/f12培养皿中，记录睾丸组织的净重；

(5)用镊子将组织尽可能的撕碎呈糊状；

(6)将枪头剪钝，转移全部组织碎片至15ml离心管，吹打数次，500rpm，2min重复三次；

(7)加10倍体积0.25％的collagenaseivsolution，37℃恒温摇床孵育15min；

(8)加入适量10mg/ml透明质酸酶使其终浓度为2mg/ml，5mg/mldnasei使其终浓度为2μg/ml和dmem/f12，37℃恒温摇床孵育15min；

(9)用钝枪头吹打组织至完全散开，无明显的组织块，500rpm水平离心3min，小心吸弃上清；

(10)加入10mlpbs均匀悬浮沉淀，反复吹打，800rpm水平离心3min，小心吸弃上清，如此再重复2次。

(11)加入适量0.25％trypsin/edta，5mg/mldnasei使其终浓度为2μg/ml，吹打均匀；

(12)将悬浮液转入100mm皿中，继续吹打消化，37℃培养箱消化10min，后重复再消化1次；

(13)加入同体积10％fbsdm/f12终止消化，将悬浮液转移到15ml离心管，2000rpm水平离心5min，小心吸弃上清；

(14)2mldm/f12(+)重悬细胞，200目细胞过滤器滤入60mm培养皿，换细胞滤器，300目细胞过滤器滤入新的50ml离心管中。

实施例二：分离获得的水牛精子细胞鉴定方法

(15)使用适量培养液重悬细胞，计数，并根据计数结果对细胞浓度进行调整。

(16)细胞计数：取滤液10μl，0.4％台盼蓝10μl混匀，显微镜下数未染色的活细胞数，计算公式为：显微镜下活细胞数/细胞所占格数×稀释倍数×10⁴；

(17)取适量细胞使用dm/f12(+)重悬，将细胞悬液转移到0.1％gelatin覆盖的100mm皿中，37℃，co2浓度为5.5％的培养箱中培养4至6小时，收集上层悬浮细胞，2000rpm，5min，小心吸弃上清，重悬培养4至6小时，重复三次，收集悬液备用。

(18)在之前睾丸细胞悬液中加入hoechst33342，调整至终浓度5μg/ml。在3.5em培养皿中加入3ml染色培养液，37℃孵育睾丸细胞60min，每隔30min吹打1次。1500r/min离心5min，仍以染色液重悬至2×10⁷个/ml，40μm过滤筛过滤，置冰上送流式分选。生精细胞包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。差异贴壁后的生精细胞染色效果如图1所示，结果表明该染色液染色效果良好，大部分的细胞胞核都染上了荧光。其中a图说明在常见光视野下有大量符合生精细胞形态的细胞，b图荧光下视野下被染上荧光染料的组织；c图将a图和b图视野进行重叠可进一步确定细胞核荧光的位置，排除其他发光物的干扰。

(19)本实验所用的流式细胞仪为bd公司的facsarialii型。选用70μm喷嘴，鞘液压力70psi。根据dna含量圈定不同倍体细胞群。分选中的前向散射光电压为220v，侧向散射光电压为286v，hoechst-blue通道的电压为264v。在4-waypurity模式下收集细胞，接收管中预先加入200μl睾丸细胞培养液，保持进样速率约为10000个/s。

流式分选后的单倍体精子细胞形态图如图2所示，其中a图常光视野下观察结果表明分离出的细胞大小形态均一，符合精子细胞的形态特征，将b图荧光视野下观察结果与a图重叠可见各细胞间的荧光光斑大小和亮度一致，说明细胞纯度较高。

(20)进行精子细胞免疫荧光鉴定，取分选得到的单倍体精子细胞，取适量滴在载玻片上，晾干，免疫组化笔画圈，室温下，在4％多聚甲醛中孵育细胞10分钟，用冰pbs洗涤；用0.1％tritonx-100孵育样品10分钟，pbs洗涤；用4％山羊血清孵育细胞30分钟；按1：200比例稀释一抗ddx4，在湿盒中孵育细胞4℃过夜，pbs洗涤；按1∶500比例稀释二抗goatanti-rabbitlggh&l，避光孵育细胞1小时，pbs避光洗涤，每次5分钟；用含dapi的封片剂封片，指甲油密封盖玻片，送荧光显微镜拍照。免疫细胞荧光效果如图3所示，a图结果表明分离的精子细胞可被非特异性的为dapi染上色；b图结果表明分离的精子细胞经荧光染色后荧光发光效果良好，a图与b图重叠得到c图，结果表明a图与b图中的荧光光斑完成重叠，说明分离得到的精子细胞纯度及活率高。

由技术常识可知，本技术方案可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。