一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法。

背景技术：

脂肪组织是以甘油三酯形式贮存脂肪的重要器官，近年来随着水生生物学的发展，对水生生物脂肪组织的认识进一步加深。黄姑鱼作为东海地区重要的养殖鱼类，其生理代谢得到了广泛的研究，但关于脂肪组织的研究甚少。

目前，鱼类脂肪细胞培养主要采用胶原酶解法进行，如申请号为201110030738.9的中国专利公开了一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包括以下步骤：1）取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；2）将上述脂肪组织经过细胞分散处理（胶原酶ii消化液），得大黄鱼前体脂肪细胞；3）将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；完全培养基为含20%胎牛血清培养液；4）原代培养：将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。待步骤4）所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，可进行传代接种培养。使用本发明的方法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。

但是本发明团队在采用上述方法对黄姑鱼进行脂肪细胞分离实验时发现，采用胶原酶解法获得的黄姑鱼脂肪组织单细胞量很少，而若增大胶原酶浓度则细胞成活率低。因此，采用上述传统的胶原酶解法并不适用于黄姑鱼。此外，本发明团队通过实验还发现，采用传统的其他鱼类的诱导方法也不能成功诱导黄姑鱼前体脂肪细胞分化成熟。因此，有必要开发出一种专门适用于黄姑鱼的前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养及其诱导方法，本发明方法能够成功获得黄姑鱼前体脂肪细胞以及进一步诱导获得成熟脂肪细胞，具有方法简便易行、重复性好、成本低和细胞生长迅速的优点，可为黄姑鱼营养代谢的分子细胞生物学研究提供有效的体外细胞模型。

本发明的具体技术方案为：一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1）先用质量分数为0.2-0.3%的胰酶溶液对黄姑鱼脂肪组织块消化5-10min，然后使用ⅱ型胶原酶消化液处理黄姑鱼脂肪组织块12-16h，获得黄姑鱼前体脂肪细胞。

2）将解离的黄姑鱼前体脂肪细胞接种到细胞培养瓶中，置于25-30℃的细胞培养箱中，采用前体脂肪细胞培养基进行培养，形成细胞单层。

本发明团队在采用专利201110030738.9中的方法对黄姑鱼进行脂肪细胞分离实验时发现，采用胶原酶解法获得的黄姑鱼脂肪组织单细胞量很少，而若增大胶原酶浓度则细胞成活率低。因此，采用上述传统的胶原酶解法并不适用于黄姑鱼。

本发明团队经过大量研究后，采用特定的两步酶解法：第一步将脂肪组织小块使用胰蛋白酶酶解，酶解作用强但时间短；第二步将脂肪组织小块使用ⅱ型胶原酶消化液低温处理，酶解作用弱，但时间长。两种酶解方法搭配不仅可以降低对细胞的损伤而且有利于获得大量单细胞。

作为优选，步骤1）中，第一次消化处理的具体方式为：室温下，使用黄姑鱼脂肪组织块体积3-4倍的胰蛋白酶溶液进行消化，接着加入含有胎牛血清的培养基中止消化；用dmem/f12培养基清洗黄姑鱼脂肪组织块。

作为优选，步骤1）中，第二次消化处理的具体方式为：离心管中加入黄姑鱼脂肪组织块体积4-5倍的ⅱ型胶原酶消化液与黄姑鱼脂肪组织块混合，置于2-6℃的层析冷柜四维旋转混合仪上以10-20rpm的速度进行消化。

作为优选，步骤1）中，所述ⅱ型胶原酶消化液的制备方法为：将ⅱ型胶原酶、胎牛血清、青霉素和链霉素添加到含有钙镁离子的汉克斯平衡盐溶液中；其中ⅱ型胶原酶的质量分数为0.08-0.12％，胎牛血清的体积分数为1.2-2.2%，青霉素的浓度为90-110iu/ml，链霉素的浓度为90-110μg/ml。

作为优选，步骤1）中，所述黄姑鱼脂肪组织块的体积为0.8-1.2mm³。

作为优选，步骤2）的具体过程为：胶原酶消化结束后，用100目尼龙筛绢过滤黄姑鱼脂肪组织块2次，将获得的单细胞悬液以700-900rpm离心8-12min，弃去上清并补充新鲜前体脂肪细胞培养基，重复3次；调整细胞浓度为0.95-1.05×10⁶个/ml，吸取1ml单细胞悬液接种于细胞培养瓶中，轻轻震荡使细胞分散均匀，静置3-4h，补加前体脂肪细胞培养基至5ml，置于细胞培养箱中培养；细胞培养期间，每天观察1次，2-3天更换培养基。

作为优选，步骤2）中，所述前体脂肪细胞培养基为含有8-12vol％胎牛血清、0.8-1.2mmol/l丙酮酸钠、1.8-2.2mmol/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、0.08-0.12g/l的n-乙酰葡萄糖胺、90-110iu/ml青霉素和90-110μg/ml链霉素的dmem/f12培养基。

本发明在前体脂肪细胞培养基中组合添加丙酮酸钠、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺和n-乙酰葡萄糖胺，本发明团队发现，当特定的上述三种组分组合在一起时，可协同配合，显著改善前体脂肪细胞糖代谢水平，促进细胞增殖及降低细胞炎症。

作为优选，步骤2）中，所述细胞培养瓶经过预处理：将黄姑鱼血清加入到细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，然后吸除多余黄姑鱼血清，25-30℃下静置24-48h。

使用黄姑鱼血清预包被瓶底一方面可以降低细胞的排异反应，增加细胞的对培养瓶的贴附；另一方面，方便易得，由于同属血清，成分相近，可减少胎牛血清使用，降低实验成本。

本发明还公开了一种对上述方法所得的黄姑鱼前体脂肪细胞进行诱导的方法：将获得的黄姑鱼前体脂肪细胞用胰酶溶液消化处理后，以4-6×10⁵/孔浓度接种到6孔板中培养3-5天，然后转移至前体细胞诱导培养基中继续培养5-7天。

其中，所述前体脂肪细胞诱导培养基为含有4-6vol％胎牛血清、0.4-0.6mm的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、8-12μg/ml胰岛素、0.2-0.3μm地塞米松、0.8-1.2vol%黄姑鱼肝脏脂质提取物、90-100iu/ml青霉素和90-110μg/l链霉素的dmem/f12培养基。

本发明团队经过实验发现，传统的诱导方法不能成功诱导黄姑鱼前体脂肪细胞分化成熟。为此，本发明在优化了脂肪前体组织细胞原代培养的酶解方法，调整了培养基的配方的基础上；在诱导培养基中添加了黄姑鱼肝脏脂质提取物，从而成功获得黄姑鱼成熟脂肪细胞。

本发明人对比了黄姑鱼肝脏脂质提取物添加与否对前体脂肪细胞诱导分化成熟的影响，发现不添加黄姑鱼肝脏脂质提取物不能诱导黄姑鱼前体脂肪细胞分化成熟。黄姑鱼前体脂肪细胞的诱导分化成熟与淡水鱼（如草鱼）不完全一样，这也是本发明的创新点之一。

作为优选，所述黄姑鱼肝脏脂质提取物为溶解有1.5-2.5g/l吐温20，0.8-1.2g/l酯化的黄姑鱼肝脏油脂和0.18-0.22g/l维生素e醋酸酯的dmem/f12培养基。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

本发明优化了鱼类脂肪前体组织细胞原代培养的酶解方法，调整了培养基的配方；在诱导培养基中添加了黄姑鱼肝脏脂质提取物，从而成功获得黄姑鱼成熟脂肪细胞。

附图说明

图1为实施例1培养第3天黄姑鱼前体脂肪细胞光镜照片；

图2为实施例1培养第1代黄姑鱼前体脂肪细胞光镜照片；

图3为实施例1培养第15代黄姑鱼前体脂肪细胞光镜照片；

图4为实施例2诱导后油红o染色的黄姑鱼成熟脂肪细胞光镜照片；

图5为两种不同酶解方法对细胞增殖的影响；

图6为两种不同培养基对细胞增殖的影响；其中：培养基+：添加丙酮酸钠、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺和n-乙酰葡萄糖胺；培养基-：不添加丙酮酸钠、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺和n-乙酰葡萄糖胺。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种黄姑鱼前体脂肪细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

1）先用质量分数为0.2-0.3%的胰酶溶液对尺寸为0.8-1.2mm³的黄姑鱼脂肪组织块消化5-10min，然后使用ⅱ型胶原酶消化液处理黄姑鱼脂肪组织块12-16h，获得黄姑鱼前体脂肪细胞。

其中，第一次消化处理的具体方式为：室温下，使用黄姑鱼脂肪组织块体积3-4倍的胰蛋白酶溶液进行消化，接着加入含有胎牛血清的培养基中止消化；用dmem/f12培养基清洗黄姑鱼脂肪组织块。

第二次消化处理的具体方式为：离心管中加入黄姑鱼脂肪组织块体积4-5倍的ⅱ型胶原酶消化液与黄姑鱼脂肪组织块混合，置于2-6℃的层析冷柜四维旋转混合仪上以10-20rpm的速度进行消化。

所述ⅱ型胶原酶消化液的制备方法为：将ⅱ型胶原酶、胎牛血清、青霉素和链霉素添加到含有钙镁离子的汉克斯平衡盐溶液中；其中ⅱ型胶原酶的质量分数为0.08-0.12％，胎牛血清的体积分数为1.2-2.2%，青霉素的浓度为90-110iu/ml，链霉素的浓度为90-110μg/ml。

2）胶原酶消化结束后，用100目尼龙筛绢过滤黄姑鱼脂肪组织块2次，将获得的单细胞悬液以700-900rpm离心8-12min，弃去上清并补充新鲜前体脂肪细胞培养基，重复3次；调整细胞浓度为0.95-1.05×10⁶个/ml，吸取1ml单细胞悬液接种于细胞培养瓶中，轻轻震荡使细胞分散均匀，静置3-4h，补加前体脂肪细胞培养基至5ml，置于25-30℃的细胞培养箱中培养；细胞培养期间，每天观察1次，2-3天更换培养基。

其中，所述前体脂肪细胞培养基为含有8-12vol％胎牛血清、0.8-1.2mmol/l丙酮酸钠、1.8-2.2mmol/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、0.08-0.12g/l的n-乙酰葡萄糖胺、90-110iu/ml青霉素和90-110μg/ml链霉素的dmem/f12培养基。

可选地，所述细胞培养瓶经过预处理：将黄姑鱼血清加入到细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，然后吸除多余黄姑鱼血清，25-30℃下静置24-48h。

一种黄姑鱼前体脂肪细胞的诱导方法，将获得的黄姑鱼前体脂肪细胞用胰酶溶液消化处理后，以4-6×10⁵/孔浓度接种到6孔板中培养3-5天，然后转移至前体细胞诱导培养基中继续培养5-7天。

其中，所述前体脂肪细胞诱导培养基为含有4-6vol％胎牛血清、0.4-0.6mm的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、8-12μg/ml胰岛素、0.2-0.3μm地塞米松、0.8-1.2vol%黄姑鱼肝脏脂质提取物、90-100iu/ml青霉素和90-110μg/l链霉素的dmem/f12培养基。

所述黄姑鱼肝脏脂质提取物为溶解有1.5-2.5g/l吐温20，0.8-1.2g/l酯化的黄姑鱼肝脏油脂和0.18-0.22g/l维生素e醋酸酯的dmem/f12培养基。

实施例1

黄姑鱼前体脂肪细胞的分离和培养方法。

步骤如下：

(1)细胞培养试剂准备，其步骤如下：

①黄姑鱼前体脂肪细胞培养基：

10％的胎牛血清、1mmol/l丙酮酸钠、2mmol/l的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、0.1g/l的n-乙酰葡萄糖胺、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养基。用高压灭菌过的1m氢氧化钠溶液调节ph到7.2-7.4。

②ⅱ型胶原酶溶液：

质量为0.1gⅱ型胶原酶（thermofisherscientific，usa）溶解于97ml含钙镁离子的汉克斯平衡盐溶液中，加入2ml胎牛血清和1ml100×双抗溶液（10000iu/ml青霉素，10mg/ml链霉素）。

(2)细胞培养瓶的预包被处理，具体步骤：黄姑鱼尾静脉取血，高速离心取血清，56℃灭活后0.22μm过滤除菌，吸取0.5ml黄姑鱼血清加入到t25细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，1小时后吸除多余黄姑鱼血清。28℃细胞培养箱静置36小时。

(3)原代培养具体步骤包括：

①实验鱼的选取：选取体重约100g健康黄姑鱼幼鱼；

②实验鱼的暂养：用含1000iu/ml青霉素和1000μg/ml链霉素的无菌海水暂养实验鱼12小时；

③脂肪组织分离：

实验鱼在解剖前用ms222麻醉，剪断鳃放血；

将实验鱼用碘伏(1％)擦拭三次，75％酒精擦拭三次；在灭菌纱布上用解剖工具解剖试验鱼。将实验鱼腹腔膜用手术刀片刮掉，然后换一把手术刀剥取腹壁脂肪组织。

④黄姑鱼脂肪组织的清洗：

用眼科镊将残存于脂肪组织的腹腔膜剥除，将明显的血管剔除；

将分离得到的脂肪组织用镊子夹取，置于70％酒精中涮洗15s后在装有pbs的青霉素小瓶中涮洗2次，再用dmem/f12培养基涮洗2次；

⑤黄姑鱼脂肪组织的酶解：

用眼科剪将脂肪组织剪成1mm³的组织块，其间不断用培养基冲洗，直至澄清；

室温下，使用组织块体积3.5倍，质量分数为0.25%胰蛋白酶溶液消化脂肪组织块8分钟，加入含有胎牛血清的培养基中止消化；

dmem/f12培养基清洗上述脂肪组织块3次；

离心管中加入脂肪组织体积4.5倍0.1%ⅱ型胶原酶与脂肪组织块混合，置于层析冷柜（4℃）四维旋转混合仪上以15rpm速度，消化14小时。

⑥黄姑鱼脂肪细胞的分离和培养：

胶原酶消化结束后，用100目尼龙筛绢过滤脂肪组织块2次，获得的单细胞悬液800rpm离心10分钟，弃去上清并补充新鲜培养基，重复3次；

调整细胞浓度约为1×10⁶个/ml，吸取1ml前体脂肪细胞悬液接种于预包被的t25细胞培养瓶中，轻轻震荡使细胞分散均匀。静置3.5小时，补加培养基至5ml，置于28℃细胞培养箱中培养；

细胞培养期间，每天观察1次，2-3天更换培养基。

⑦实验结果：

原代培养启动后3天，可见少量前体脂肪细胞贴于瓶底(图1)；原代培养启动后约10天，细胞集落相互汇合形成单细胞层，细胞形状均一，生长状态良好(图2)；第15代黄姑鱼前体脂肪细胞的光镜照片显示细胞分裂旺盛，状态良好（图3）。

实施例2

黄姑鱼前体脂肪细胞诱导（在实施例1的基础上）

(1)黄姑鱼前体脂肪细胞诱导培养基制备，其步骤如下：

①黄姑鱼肝脏脂质提取物制备：

取10g黄姑鱼肝脏匀浆、10ml蒸馏水和0.1g维生素e醋酸酯置于50ml锥形瓶中，加塞子密封置于恒温振荡器隔水加热1小时，水温45℃，4500rpm离心10分钟,并用热的饱和氯化钠溶液和少量冰醋酸清洗3次，最后用蒸馏水清洗1次，分离出上层油脂，鼓风干燥低温烘干。

称取油脂1g加入足量1m氢氧化钠溶液，隔水加热使之完全酯化。

在上述处理的油脂中加入0.2g维生素e醋酸酯和2.5g吐温20，dmem/f12定容至1l即制成100×黄姑鱼肝脏脂质提取物。

②黄姑鱼前体脂肪细胞诱导培养基：

体积分数5％的胎牛血清、0.5mm的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/ml的胰岛素、0.25μm地塞米松、1×黄姑鱼肝脏脂质提取物、100iu/ml青霉素和100μg/l链霉素的dmem/f12培养基。

(2)前体脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞：

将细胞用0.25%胰酶消化处理成单细胞后，以5×10⁵/孔浓度接种到6孔板中培养4天，进而更换为前体细胞诱导培养基培养细胞6天。油红o染色，倒置显微镜拍照。

如图4所示，结果显示，前体脂肪细胞形变为椭圆形，边缘模糊，细胞器基本消失，细胞核被染成紫色，细胞中充满大小不等被染成红色的脂滴。

验证试验：

1、本发明酶解方法的技术效果验证：采用两种方法进行酶解，具体如下：

方法1：先胶原酶后胰蛋白酶的两步酶解法（与实施例1仅仅是顺序相反）；

方法2：采用实施例1的先胰蛋白酶后胶原酶的两步酶解法。

本发明人进行了相关的对比试验，测定了两种不同的酶解方法（方法1和方法2）处理下细胞的增殖情况。如图5所示，采用方法2的酶解方法培养的细胞分裂旺盛，经7-10天培养，细胞生长处于平顶期；相反，采用方法1的酶解方法严重降低脂肪细胞活力，经7-10天培养，细胞基本死亡，未观察到细胞增殖现象。故本发明的两步酶解法适用于前体脂肪细胞培养。

2、丙酮酸钠、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺和n-乙酰葡萄糖胺对细胞增殖的促进作用：

本发明人进行了相关的对比试验，测定了两种不同培养基处理下细胞的增殖情况。实验发现，如图6所示，相比不添加丙酮酸钠、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺和n-乙酰葡萄糖胺，添加以上三种物质可以显著促进黄姑鱼前体脂肪细胞的增殖。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。