抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】公开了一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，该细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性，并且在移植之后能够归巢至淋巴结。该方法包括：(a)在IL-21的存在下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以便允许富集抗原反应性细胞；和(b)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(a)的所述细胞，以便允许增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
【专利说明】抗第三方中央型记忆T细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明在其一些实施方式中涉及包含中央型记忆T淋巴细胞表型的耐受诱导(tolerance inducing)和/或移植物抗白血病(graft versus leukemia)反应性抗第三方细胞，并且更具体地但不排他地涉及其产生方法并且涉及其在移植中和在疾病治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]骨髓(BM)移植为患有血液系统恶性肿瘤及其他血液疾病的患者提供了治愈性治疗。但是，BM移植物包含供体T细胞，其响应宿主抗原(Ag)并且引起多系统的移植物抗宿主病(GVHD)。在80年代初，在半相合(三HLA位点不匹配)设置(setting)中、在重症联合免疫缺陷(SCID)患者中证明了没有GVHD的有害影响的骨髓移植(BMT)。在这样的设置中几乎是一致致命的GVHD问题由于T细胞耗竭而完全被防止。
[0003]然而，在白血病患者中，T细胞耗竭的BM的临床结果是令人失望的，因为GVHD防止的益处被显著增加的移植物排斥反应速率抵消。显示，该排斥反应是由放射化学疗法耐性宿主来源的T细胞所介导的[Reisner等，Proc Natl Acad Sci U SA.(1986)83:4012-4015]。克服这个问题的一个方法是在使用免疫抑制药物超致死调理(调节，conditioning)和功能失活宿主T细胞之后进行BMT。尽管如此，这种策略由于缓慢的免疫重建和相当毒性 的免疫抑制剂所致的机会性感染而受到阻碍。
[0004]虽然在高风险白血病患者中，这种移植相关的致命性是可以接受的，但是如果应用至具有较长预期寿命的患者，这将是无法忍受的。因此，使用降低强度的调理，连同不太严重的免疫消融，来促使与降低GVHD的风险相关联的T-耗竭的BM(TDBM)移植物的植入是必要的(warranted)。在这种降低的调理下确立供体型嵌合状态代表了移植生物学中最令人向往的目标，因为其通常与针对来自原始供体的细胞或组织的持久耐受性相关联。然而，经受住(surviving)温和的预备疗法(preparatory regimen)的宿主免疫细胞的显著水平代表植入供体细胞的艰难障碍。
[0005]克服排斥异源TDBM的一种方法利用了大细胞剂量。首次在啮齿类动物模型中证明了“大剂量(megadose) ”的TDBM移植可以克服T细胞介导的移植物排斥反应[Lapidot等,Blood(1989) 73:2025-2032 ；Bachar-Lustig 等,Nat Med.(1995) 1:1268-1273 ；Uharek等，Blood (1992) 79:1612-1621]。但是，在人类中一直难以实现BM接种物的显著增加。为了克服这个问题，已经使用促进来自BM的造血干细胞(人类中的HSC、⑶34+细胞)的动员(mobilization)的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)来提高采集自血液的HSC的产率，并且将T细胞耗竭的HSC补充至常规TDBM中[Aversa等，N Engl JMed.(1998)339:1186-1193 ；Aversa 等,J Clin Oncol.(2005)23:3447-3454 ;Reisner和 Martelli, Immunol Today (1999)20:343-347 ；Handgretinger 等，Bone MarrowTransplant.(2001)27:777-783]?[0006]⑶34的“大剂量”移植提出有趣的问题，即这些细胞如何克服由宿主细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)给出的屏障。这个问题部分地由以下发现所回答，即⑶34部分中的细胞被赋予(endow) 了强有力的禁止活性(否决活性，veto activity) [Gur等，Blood (2005) 105:2585-2593 ；Gur 等，Blood (2002) 99:4174-4181 ;Rachamim等，Transplantation (1998) 65:1386-1393]。其他细胞类型也已经显示出介导禁止活性，包括T淋巴细胞(例如CD8+CTL)、自然杀伤细胞和树突状细胞。各种细胞类型的禁止反应性的直接比较显示，CTL 包含最强的禁止效果[Reich-Zeliger 等，JImmunol.(2004) 173:6654-6659]。
[0007]Reisner与其同事描述了已开发出一种产生无GVH反应性的禁止CTL的方法，其中在没有外源性IL-2的条件下针对第3方刺激子来刺激CTL。这种方法基于观察到的在原代培养物中只有活化的CTLp能够经受住IL-2脱除。在体外和体内都显示，这种方法耗尽了来自抗第3方禁止CTL的GVH反应性[PCT
【发明者】们已经发现了一种抗第三方中央型记记T(Tcm)细胞的改进的群体，其在移植后归巢至淋巴结并且诱导耐受性和抗疾病活性(例如移植物抗白血病(GVL)活性)而不诱导移植物抗宿主(GVH)反应。
[0118]如下文中以及随后的实施例章节中所示出的，本
【发明者】们提供了产生用于同种异体和自体应用的Tcm细胞的方法。如图1A和图21所示的，通过首先在IL-21的存在下将CD8+T细胞暴露于同种异体刺激物(例如树突状细胞)接触3天，随后向具有抗原刺激物的细胞中加入IL-15和IL-7，再接触I至2天，从而产生了赋有抗疾病活性(例如抗肿瘤活性)的自体Tcm细胞。随后，在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下将所获得的细胞再培养6至8天。
[0119]如图1B和图22所描绘的，通过首先在IL-21的存在下将⑶8+T细胞暴露于第三方刺激物(例如树突状细胞)3天，产生了同种异体Tcm细胞，其是耐受性诱导细胞并且赋有GVL活性。从培养开始约14小时后，通过阳性选择⑶137+来选择经活化的细胞，并且用IL-21再培养这些细胞。随后，向具有抗原刺激物的IL-21培养物中添加IL-15和IL-7再培养I至2天。随后，在无抗原的环境中在IL-21、IL-15和IL-7的存在下将所获得的细胞再培养6至8天。在培养结束时，在使Tcm细胞与宿主型抗原呈递细胞(例如树突状细胞)接触之后，通过耗尽CD137+细胞来耗尽Tcm细胞的同种异体反应性细胞。
[0120]由本
【发明者】们产生的细胞包含多于50%的⑶3+⑶8+细胞并且包含TCR非依赖性抗白血病活性(参见实施例2)，⑶3+⑶8+细胞的多于50%是Tcm细胞(即包含⑶3+、⑶8+、⑶62L+、⑶45RA-、⑶4 5R0+标记，例如参见下列实施例章节的实施例1)。
[0121]合起来看，这些结果证实，在同种异体移植是必要的情况下(例如造血干细胞移植或实体器官移植)，抗第三方Tcm细胞能够用作移植物促进细胞并且用于疾病治疗。另外，这些结果证实，在需要自体移植的情况下(例如对于血液系统恶性肿瘤而言)，第三方Tcm细胞能够在疾病治疗中进行应用。
[0122]因此，根据本发明的一个方面，提供了包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的非-GVHD诱导抗第三方细胞的细胞的分离群体，细胞是耐受性诱导细胞并且在移植之后能归巢至淋巴结。
[0123]本文中使用的用语“细胞的分离群体(isolated population of cells)”是指已经从它们的自然环境(例如人体)中分离出来的细胞。
[0124]本文中使用的术语“非-GVHD(non-GVHD)”是指具有显著降低的移植物抗宿主诱导反应性或不具有移植物抗宿主诱导反应性。因此，正如在移植后的100天内通过受移植的受试者的生存、体重和整体外表所证明的，所产生的本发明的细胞不会显著导致移植物抗宿主病(GVHD)。
[0125]本文中使用的术语“同源的(syngeneic) ”是来源于基本上与受试者基因相同的个体的细胞或组织。典型地，基本上完全近交的哺乳动物、哺乳动物克隆或纯合子孪生哺乳动物是同源的。
[0126]同源细胞或组织的实例包括来源于受试者的细胞或组织(在本领域中也称为“自体的”)、受试者的克隆或受试者的纯合孪生子。[0127]本文中使用的术语“非同源的(non-syngeneic) ”是指来源于与受试者的淋巴细胞是同种异体的(allogeneic)或异种的(xenogeneic)个体的细胞或组织。
[0128]本文中使用的术语“同种异体的(同种异型的、同种异基因的，allogeneic)”是指来源于与受试者是相同的物种但是与受试者基本上是非克隆的供体的细胞或组织。典型地，相同物种的远交(outbred)系、非合子(non_zygotic)孪生哺乳动物彼此之间是同种异体的。但应当理解的是，相对于受试者，同种异体供体可以是HLA相同或HLA不相同的。
[0129]本文中使用的术语“异种的(xenogeneic) ”是指细胞或组织其相对于受试者的相当大比例的淋巴细胞的种类而言，基本上表达不同种类的抗原。典型的，不同种类的远交哺乳动物彼此之间是异种的。
[0130]本发明设想了来源于各种物种的异种细胞或组织，例如但不限于牛科动物(例如，奶牛)、马科动物(例如，马)、猪类(例如猪)、羊科动物(OVids)(例如，山羊、绵羊)、猫科动物(例如，家猫(Felis domestica))、犬科动物(例如，家犬(Canis domestica))、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)或灵长类(例如，黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴)。
[0131]异种来源(例如猪源)的细胞或组织优选获自已知没有人畜共患病(zoonose)(如，猪内源性逆转录病毒)的来源。类似地，人类来源的细胞或组织优选获自基本上无病原体的来源。
[0132]本文中使用的用语“抗-第三方细胞(ant1-third party cell) ”是指革巴向(例如通过T细胞识别)一种 或多种第三方抗原的淋巴细胞(例如T淋巴细胞)。
[0133]本文中使用的用语“一种或多种第三方抗原(third party antigen orantigens) ”是指在供体或接受者中不存在的可溶性或不溶性(例如膜相关的)的一种抗原或多种抗原，如下文中的详细描述。
[0134]例如，第三方抗原可以是第三方细胞、病毒的抗原，如例如埃-巴二氏病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)或细菌的抗原，如鞭毛蛋白。病毒性抗原或细菌性抗原可通过用其感染的细胞(例如细胞系)来呈递或由通过其他方式使细胞来表达病毒/细菌蛋白质。自体或非自体抗原呈递细胞可以用来呈递与其融合或负载的短合成肽。此类短肽可以是病毒来源的肽或代表任何其他抗原的肽。
[0135]可以使用专用软件来分析病毒或其他序列以鉴定免疫原性短肽，即，I类MHC或II类MHC中存在的肽。
[0136]相对于接受者来说，第三方细胞可以是同种异体的或异种的(下文中进行了进一步的详细说明)。在同种异体第三方细胞的情况下，此类细胞具有不同于供体但是其与接受者HLA抗原不发生交叉反应的HLA抗原，以便针对此类细胞产生的抗第三方细胞不具有针对移植体或接受者抗原的反应性。
[0137]根据本发明的一个实施方式，同种异体或异种的第三方细胞是选自由纯化自外周血淋巴细胞(PBL)、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞(DC)和人工抗原呈递细胞的细胞组成的组的刺激细胞。
[0138]本发明的人工APC可以被设计以表现与第3方肽或第3方MHC的自体MHC，而不会与外源肽致敏(pulsed)。因此，根据一个实施方式，人工APC包含用第三方MHC决定簇(determinant)和共刺激分子转染的K562肿瘤细胞[如先前所描述的，例如Suhoski MM等，Mol Ther.(2007) 15 (5):981-8]、或者使用第三方MHC决定簇和共刺激分子转染的成纤维细胞。
[0139]第三方抗原可呈递在细胞、病毒或细菌的表面上或者由其衍生和/或纯化。此外，病毒或细菌抗原可展示(display)在被感染的细胞上，而细胞抗原可以展示在人工载体(例如脂质体)或人工抗原呈递细胞(例如用一种或多种第三方抗原转染的白血病或成纤维细胞系)上。
[0140]第三方抗原可以进一步包括由自体呈递细胞、非自体呈递细胞呈递的或呈递在人工载体或人工抗原呈递细胞上的合成肽。
[0141]另外，第三方抗原例如可以是提取或纯化自各种来源的蛋白质。可以用作本发明的第三方抗原的纯化的蛋白质的实例是卵白蛋白。可以设想其他实例。
[0142]利用细胞、病毒、细菌、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、病毒肽呈递细胞或细菌肽呈递细胞作为第三方抗原是特别有利的，因为此类第三方抗原包括多样化的抗原决定簇并且如此引导形成多样化群体的抗第三方细胞，在需要此类重建的情况下，这可以进一步用于更快速地重建T细胞例如在经过致死或亚致死的辐射或化疗过程之后。
[0143]此外，当抗第三方细胞针对第三方抗原时，细胞被赋有抗疾病活性。术语“抗疾病活性(ant1-disease activity) ”是指Tcm细胞抵抗患病细胞(例如癌症细胞,如移植物抗白血病(GVL)活性)的活性(例如，杀灭能力)。这种活性典型地是由于由LFAl-1/CAMl结合介导的TCR非依赖性杀灭所带来的[Arditti等，Blood (2005) 105 (8):3365-71.Epub2004Jul6]。
[0144]根据本发明的一个实施方式，第三方细胞包含树突状细胞。
[0145]根据本发明的一个实施方式，第三方细胞包含成熟树突状细胞。
[0146]产生第三方树突状细胞(其可以用作用于诱导Tcm细胞的刺激细胞)的方法在本领域中是众所周知的。因此，作为非限制性的实例，可以从第三方非同源细胞供体获得外周血单核细胞(PBMC)[例如在Tcm细胞是同源的情况下，例如自体的，那么相对于受试者，树突状细胞(DC)可以是非同源的，例如同种异体的；而当Tcm细胞是非同源的，例如同种异体的，那么DC选自于是非同源的供体，例如同种异体的，并且HLA与受试者和Tcm细胞都是不匹配的]。然后，可以通过塑料吸附并且使用补充有人血清(例如1%的人血清)、青霉素/链霉素和GM-CSF(800IU/ml)以及IL-4 (20ng/ml)(可获自例如Peprotech, Hamburg, Germany)的DC细胞培养基进行培养(例如在细胞培养板中)来分离单核细胞。在培养约48小时后，可以添加包含GM-CSF(1600IU/ml)和IL_4(20ng/ml)的DC培养基。约24小时后，可以收获非贴壁细胞，并且可以将大细胞(大多为不成熟的DC)重新悬浮于含有 GM-CSF (800IU/ml)、IL-4(20ng/ml)、LPS 例如来自大肠杆菌 055:B5，IOng/ml)和IFNy 100IU/ml)(可获自例如Peprotech, Hamburg, Germany)的新鲜培养基中，接种并且孵育过夜。第二天，可以弃去非贴壁细胞，并且在冰下孵育20分钟后，使用例如冷的PBS/1 % HS温和地取出贴壁的DC，从而获得了由成熟DC组成的大细胞。
[0147]根据一个实施方式，第三方细胞包含经辐射的树突状细胞。
[0148]因此，根据一个实施方式，以约5-1OGy、约10_20Gy、约20_30Gy、约20_40Gy、约20-50Gy、约10-50Gy来辐射DC。根据一个具体的实施方式，以约10_50Gy (例如30Gy)来辐射DC。[0149]根据一些实施方式，本发明的抗第三方细胞包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型。
[0150]本文中使用的用语“中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型(central memoryT-1ymphocyte (Tcm) phenotype) ”是指归巢至淋巴结的T细胞毒性细胞的子集。在人类中，具有Tcm表型的细胞典型地包含CD3+/CD8+/CD62L+/CD45R0+/CD45RA-标记。可以理解的是，Tcm细胞可以在单个细胞上表达所有的标记的标志物或者可以在单个细胞上供表达标记的标志物的一部分。
[0151]可以理解的是，细胞的分离群体的至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或甚至100 %是⑶3+⑶8+细胞。根据具体的实施方式，细胞的分享群体包含约70-90 %的⑶3+⑶8+细胞。
[0152]可以理解的是，⑶3+⑶8+细胞的至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或甚至100%具有Tcm细胞标记。根据具体的实施方式，约30-80%的⑶3+⑶8+细胞具有Tcm细胞标记(例如40-50% )。
[0153]根据一个实施方式，提供了包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，其中细胞的分离群体的至少50%是⑶3+⑶8+细胞，该⑶3+⑶8+细胞的至少50%包含⑶3+、⑶8+、⑶62L+、⑶45RA'⑶45R0+标记，并且进一步地，其中细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性(例如移植物抗白血病(GVL)活性)，并且在移植之后能够归巢至淋巴结。
[0154]如前，Tcm细胞典型地在移植之后归巢至淋巴结。根据一些实施方式，本发明的抗第三方Tcm细胞在移植之后可以归巢至淋巴结，例如，外周淋巴结和肠系膜淋巴结。这些细胞的归巢特性使得它们能够以快速且有效的方式发挥其耐受性作用。
[0155]因此，本发明的抗第三方Tcm细胞是耐受性诱导细胞。
[0156]本文中使用的用语“耐受性诱导细胞(tolerance inducing cell)”是指这样的细胞，与不存在经给予的耐受性诱导细胞的接受者的细胞(例如接受者的T细胞)的响应性相比，当接受者的细胞接触细胞时，细胞降低了接受者的细胞的响应性。耐受性诱导细胞包括禁止细胞(即导致与其接触的宿主T细胞凋亡的T细胞)，如先前在PCT
【发明者】通过繁重的实验和筛选采集了许多标准，其可以被用来改进包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的增殖，该抗第三方细胞没有移植物抗宿主(GVH)反应性细胞和/或是增强的抗疾病(如GVL)反应性细胞。
[0167]根据一个实施方式，在IL-21的存在下与一种或多种第三方抗原接触之前，PBMC耗尽了非贴壁细胞。
[0168]根据一个实施方式,在IL-21的存在下与一种或多种第三方抗原接触之前，PBMC耗尽了⑶4+和/或⑶56+细胞。
[0169]根据一个实施方式 ，在IL-21的存在下与一种或多种第三方抗原接触之前,对PBMC选择CD45RA+细胞。
[0170]可以使用本领域中众所周知的方法来进行⑶4+和/或⑶56+细胞的耗尽，如通过基于亲和力的纯化(例如，通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)。为了提高培养物中的CD8+细胞的纯度(即，消除细胞培养物中的其他淋巴细胞，如T CD4+细胞或NK细胞)或为了提高CD8+T细胞的数量，该步骤可能是有益的。
[0171]根据一个实施方式，PBMC包含非贴壁细胞。
[0172]根据一个实施方式，PBMC包含⑶8+T细胞。
[0173]根据一个实施方式，PBMC包含幼稚⑶8+T细胞。
[0174]可以通过选择表达⑶45RA+的细胞和/或表达⑶45R0-的细胞来实现幼稚⑶8+T细胞的选择，并且可以使用本领域中众所周知的方法来进行幼稚CD8+T细胞的选择，如通过基于亲和力的纯化(例如，通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)。
[0175]根据一个实施方式，PBMC包含⑶45RA+细胞。
[0176]根据本发明的教导可以进行的另外的步骤包括:在从细胞培养物中去除一种或多种第三方抗原之前(即在产生无抗原的环境之前)，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下使用一种或多种第三方抗原培养PBMC细胞。这个步骤典型地进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1_2天、2_3天、1_3天、2-4天、1-5天或2-5天，并且是以相同于以上所示剂量的IL-21、IL-15和IL-7来实现的。根据具体的实施方式，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下使用一种或多种第三方抗原对PBMC细胞培养12小时至4天(例如1-2天)。
[0177]另外地或可替代地，可以进行允许选择和分离经活化的细胞的另外的两个步骤过程。在PBMC与受试者非同源的情况下，此类选择步骤有助于去除潜在的宿主反应性T细胞(如下进一步的详细描述)。
[0178]因此，可以两阶段方法来进行分离经活化的细胞。在第一阶段，在IL-15和IL-7的存在下培养细胞之前选择经活化的细胞。该第一阶段典型地是在IL-21的存在下，使PBMC与一种或多种第三方抗原初步接触之后来进行的。该选择过程仅选取可以由第三方抗原活化的那些细胞(例如表达以下的活化标志物)，并且典型地在PBMC与一种或多种第三方抗原的初步接触之后，进行约12-24小时、约24-36小时、约12-36小时、约36-48小时、约12-48小时、约48-60小时、约12-60小时、约60-72小时、约12-72小时、约72-84小时、约12-84小时、约84-96小时、约12-96小时。根据具体的实施方式，选择过程在PBMC与一种或多种第三方抗原的初步接触之后进行约12-24小时(例如14小时)。
[0179]分离经活化的细胞可以通过基于亲和力的纯化来进行(例如，通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)并且可以针对任何活化标志物(包括细胞表面标志物，例如但不局限于⑶69、⑶44、⑶25、CFSE、⑶137 ;或者非细胞表示标志物，例如但不局限于IFN-Y和IL-2)来进行。分离经活化的细胞还可以使用本领域中众所周知的方法(例如通过FACS)通过基于形态学的纯化(例如分离大细胞)来进行。典型地，也从经活化的细胞中选择表达CD8+的细胞。另外，可以利用上述方法的任何组合来有效地分离经活化的细胞。
[0180]根据本发明的一个实施方式，选择经活化的细胞是通过选择⑶137+和/或⑶25+细胞来进行的。
[0181]经活化的细胞的分离的第二阶段典型地是在培养结束时进行的(即在无抗原的环境中用IL-21、IL-15和IL-7培养之后)。该阶段通过耗尽在使中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)与经辐射的宿主抗原呈递细胞(APC，例如树突状细胞)接触之后活化的那些细胞而耗尽同种异体反应性细胞。如上所描述的，分离经活化的细胞可以通过基于亲和力的纯化(例如通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)来进行并且可以针对任何活化标志物(包括细胞表面标志物，例如但不局限于⑶69、⑶44、⑶25、CFSE,⑶137 ;或者非细胞表不标志物，例如但不局限于IFN-Y和IL-2)来进行。
[0182]根据本发明的一个实施方式，耗尽同种异体反应性细胞是通过耗尽CD137+和/或⑶25+细胞来进行的。
[0183]以下是可以根据本发明的一些实施方式进行使用的方案的一些非限制性实例。
[0184]根据本发明的一个实施方式，提供了一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性(例如移植物抗白血病(GVL)活性)，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，该方法包括:(a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁的外周血单核细胞(PBMC)，以便获得⑶8+T细胞；(b)在IL-21的存在下使该⑶8+T细胞与第三方树突状细胞接触12小时至5天，以便能够富集抗原反应细胞；(c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用第三方树突状细胞培养获自步骤(b)的细胞12小时至3天；和(d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下培养获自步骤(c)的细胞5_20天，以便能够增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
[0185]以上所描述的方案典型地用于非同源移植并且因此所使用的PBMC典型地相对于受试者而言是同种异体的(例如来自同种异体供体)。[0186]根据本发明的一个实施方式，提供了一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，细胞赋有抗疾病活性(例如抗肿瘤细胞活性)，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，该方法包括:(a)用能够耗尽⑶4+和/或⑶56+细胞的试剂处理非贴壁的外周血单核细胞(PBMC)，以便获得CD8+T细胞；(b)在IL-21的存在下使该CD8+T细胞与非同源树突状细胞接触12小时至5天，以便能够富集抗原反应细胞；
(c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用非同源树突状细胞培养获自步骤(b)的细胞12小时至3天；和(d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(c)的细胞5-20天，以便能够增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
[0187]上述方案典型地用于同源移植并且因此所使用的PBMC典型地相对于受试者而言是自体的(例如来自该受试者)。
[0188]因此，如上提及的，PBMC相对于受试者而言可以是同源的或非同源的。
[0189]根据本发明的一些实施方式，本发明的非同源PBMC相对于受试者而言可以是同种异体的或异种的(以下进行了进一步的详细说明)。
[0190]将相对于该细胞的预定用途来确定PBMC的来源(参见下文进一步详细的说明)并且完全处于本领域技术人员的能力范围内，特别是鉴于本文所公开的详细内容。
[0191]在需要消除移植物排斥反应且克服移植物抗宿主病(GVHD)的情况下，例如在同种异体和异种细胞或 组织的移植中，使用耐受性诱导细胞是特别有益的。
[0192]因此，根据本发明的另一方面，提供了一种治疗需要细胞或组织移植的受试者的方法，该方法包括将细胞或组织移植体移植入受试者中并且向该受试者给予治疗有效量的细胞的分离群体。
[0193]本文中使用的术语“治疗(treating) ”包括终止(abrogate)、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床或美学症状或者基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
[0194]本文中使用的术语“受试者(subject) ”或“需要其的受试者”是指哺乳动物，优选人类，任何年龄的男性或女性，他们需要细胞或组织移植或者患有可以使用Tcm细胞进行治疗的疾病。典型地，由于可以通过细胞或组织移植进行治疗的疾病或病理或不希望的病症、状态、或症状、或身体异常、形态异常或生理异常，受试者需要细胞或组织移植(本文中也称为接受者)。以下提供了此类疾病的实例。
[0195]本文中所使用的用语“细胞或组织移植”是指身体的细胞(例如单个细胞或一组细胞)或组织(例如实体组织/器官或软组织，其可以全部或部分地移植)。可以根据本发明的教导移植的示例性组织或器官包括但不限于肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺、皮肤、肠和淋巴/造血组织(例如淋巴结、派尔(Peyer)氏斑胸腺或骨髓)。可以根据本发明的教导移植的示例性细胞包括但不限于未成熟的造血细胞，包括干细胞。另外，本发明还考虑了整个器官的移植，例如肾脏、心脏、肝脏和皮肤。
[0196]取决于应用，可以使用与受试者同源或非同源的细胞或组织来实现方法。
[0197]根据本发明的一个实施方式，受试者和供体都是人类。
[0198]取决于应用和可用的来源，本发明的细胞或组织可以获自产前有机体、产后有机体、成人或尸体供体。另外，取决于应用，的细胞或组织可以是幼稚的或基因修饰的。此类确定完全处于本领域普通技术人员的能力范围内。[0199]可以利用本领域中已知的任何方法来获得细胞或组织(例如，用于移植)。
[0200]可以以许多方式来实现细胞或组织向受试者的移植，其取决于不同的参数，例如细胞或组织类型；接受者的疾病的类型、阶段或严重度(例如，器官功能衰竭)；特定于受试者的身体或生理参数；和/或所期望的治疗结果。
[0201]本发明的细胞或组织移植体的移植，取决于应用，可以通过将细胞或组织移植体移植至各种解剖位置的任何一处来实现。细胞或组织移植体可以移植至同位(homotopic)解剖位置(用于移植体的正常的解剖位置)、或至异位(ectopic)解剖位置(用于移植体的非正常的解剖位置)。取决于应用，可以有利地将细胞或组织移植体植入在肾小囊下或植入至肾脏、睾丸脂肪、皮下(sub cutis)、大网膜、门静脉、肝脏、脾脏、心脏腔、心脏、胸腔、肺脏、皮肤、胰腺和/或腹腔内的空间中。
[0202]例如，根据本发明的教导，肝组织可以被移植到肝脏、门静脉、肾小囊、皮下、大网膜、脾脏和腹腔内的空间中。将肝移植至各种解剖位置在本领域中被普遍地实行用于治疗可以由通过肝脏移植术进行治疗的疾病(例如肝功能衰竭)。类似地，根据本发明的胰腺组织的移植可以通过将该组织移植至门静脉、肝、胰腺、睾丸脂肪、皮下、大网膜、肠袢(小肠的U形环的浆膜下层)和/或腹腔内的空间中来实现。胰腺组织的移植可以用来治疗可以通过胰腺移植进行治疗的疾病(例如糖尿病)。同样地，可以将肾脏、心脏、肺或皮肤组织等的组织移植到上述的任何解剖位置以用于治疗患有例如肾功能衰竭、心脏衰竭、肺衰竭或皮肤损伤(例如烧伤)的接受者。
[0203]本发明的方法例如还可以用于治疗患有需要不成熟的造血干细胞移植的疾病的接受者。
[0204]在后一种情况下，可以将来源于例如供体的骨髓、动员的外周血(例如通过白细胞分离法)、胎肝、卵黄囊和/或脐带血的未成熟的自体、同种异体或异种的造血细胞(包括干细胞)且优选是T细胞耗竭的CD34+未成熟造血细胞移植到患有疾病的接受者中。此类疾病包括但不限于白血病，如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性非淋巴母细胞性白血病(ANLL)、急性髓细胞性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML);严重联合免疫缺陷综合征(SCID),包括腺苷脱氨酶(ADA)、骨硬化病(石骨症，osteopetrosis)、再生障碍性贫血、高雪氏病(Gaucher’s disease)、地中海贫血症和其他先天性或遗传决定的造血异常。
[0205]可以理解的是，可以使用本领域中已知的用于细胞移植的任何方法来将本发明的未成熟的自体、同种异体或异体的造血细胞移植至接受者中，例如但不限于细胞输注(例如1.V.)或通过腹膜内途径。
[0206]可选地，当将本发明的细胞或组织移植体移植到具有有缺陷的器官的受试者中时，可能有利的是首先至少部分地从受试者中移除衰退的器官，从而使移植体的发展及其结构/功能与该受试者的解剖学/生理学的一体化获得最佳化。
[0207]根据一个实施方式，未成熟的造血细胞和细胞的分离群体来源于同一供体。
[0208]根据一个实施方式，未成熟的造血细胞和细胞的分离群体来源于同一受试者。
[0209]本发明的方法还设想了联合移植多个器官(例如心脏和肺组织)，在这种情况下，受试者可以通过此步骤而获得有益的影响。
[0210] 根据一个实施方式，联合移植包括移植未成熟的造血细胞和实体组织/器官或一些实体器官/组织。[0211]根据一个实施方式,未成熟的造血细胞和实体器官或获自同一供体。
[0212]根据另一个实施方式，未成熟的造血细胞和实体器官/组织或多个器官/组织获自不同的(非同源的)供体。
[0213]根据一个实施方式，未成熟的造血细胞是在移植实体器官之前、同时或之后进行移植的。
[0214]根据一个实施方式，首先通过将未成熟的造血细胞连同本发明的Tcm细胞一起移植以在受试者中诱导造血嵌合，引起移植自同一供体的其他组织/器官的耐受性。
[0215]根据一个实施方式，使用本发明的Tcm细胞本身来减少对移植自同一供体的移植的组织/器官的排斥反应。
[0216]在进一步的实施方式中，细胞或组织移植体以及细胞的分离群体来源于同一供体。
[0217]在进一步的实施方式中，细胞或组织移植体与受试者是同源的，而细胞的分离群体与受试者是非同源的。
[0218]在进一步的实施方式中，细胞或组织移植体与受试者是同源的，且细胞的分离群体与受试者是同源的。
[0219]在根据本发明的教导将细胞或组织移植体移植到受试者中之后，根据标准的医疗实践，最好是根据现有技术的各种标准技术的任何一种来监测脏器的生长功能和免疫相容性。例如，可以在移植之后通过标准的胰腺功能检查(例如，胰岛素的血清水平的分析)来监测胰腺组织移植体的功能。同样地，在移植之后可以通过标准的肝功能检查(例如，白蛋白、总蛋白、ALT、AST和胆红素的血清水平的分析，以及血液凝血时间分析)来监测肝组织移植体。可以通过计算机化断层扫描或超声成像来监测细胞或组织的结构性发展。
[0220]取决于移植的背景，为了有利于细胞或组织移植体的移植，方法可以进一步有利地包括在移植之前在亚致死、致死或超致死的条件下调理受试者。
[0221]当涉及调理本发明的受试者时，本文使用的术语“亚致死(sublethal) ”、“致死(lethal) ”和“超致死(supralethal) ”，是指骨髓毒性和/或淋巴细胞毒性治疗，当将治疗分别应用于受试者的代表性群体时，典型地为:基本上对群体的所有成员都是非致死的；对一些但并非该群体的所有成员是致死的；或在正常的无菌条件下，对该群体的所有成员基本上都是致死的。
[0222]根据一个实施方式，该调理步骤是通过在超致死的条件下对受试者进行调理的，例如在清髓性(myeloablative)条件下。
[0223]可替代地，该调理步骤是在致死或亚致死条件下对受试者进行调理的，例如通过在减髓性(myeloreductive)条件下调理受试者。
[0224]可以用来调理受试者的调理剂的实例包括但不限于辐射、药理剂和耐受性诱导细胞(如本文所描述的)。
[0225]药理剂的实例包括骨髓毒性药物、淋巴细胞毒性药物和免疫抑制药物。
[0226]骨髓毒性药物的实例包括但不限于白消安、二甲基马利兰(mileran)、马法兰和塞替派。
[0227]方法可以进一步有利地包括在移植细胞或组织移植体之前、同时或之后使用免疫抑制方案来调理受试者。[0228]适合类型的免疫抑制方案的实例包括给予免疫抑制药物、耐受性诱导细胞群体(如下文中详细描述的)和/或免疫抑制性辐射。
[0229]在现有技术的文献中提供了用于选择和施用适合于移植的免疫抑制方案的大量指导(例如，参见:Kirkpatrick CH.和 Rowlands DT Jr.，1992.JAMA.268，2952 ；Higgins RM.等，1996.Lancet348, 1208 ；Suthanthiran M.和 Strom TB., 1996.New Engl.J.Med.331，365 ；Midthun DE.等，1997.Mayo Clin Proc.72，175 ；Morrison VA.等，1994.Am J Med.97, 14 ；Hanto Dff., 1995.Annu Rev Med.46, 381 ；Senderowicz AM.等，1997.Ann Intern Med.126, 882 ；Vincenti F.等,1998.New Engl.J.Med.338, 161 ；Dantal J.等1998.Lancet351, 623)。
[0230]优选地，免疫抑制方案由向受试者给予至少一种免疫抑制剂组成。
[0231]免疫抑制剂的实例包括但不限于:甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢素、环孢菌素A、氯喹、轻氯喹、柳氮磺胺吡唳(柳氮磺吡唳，sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNFa阻断剂、靶向炎性细胞因子的生物制剂以及非类固醇抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于:乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酸酯(salsalate)、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、曲马多、雷帕霉素(西罗莫司)和雷帕霉素类似物(例如CC1-779、RAD001、AP23573)。这些试剂可以单独给予或组合给予。
[0232]与移植体的类型无关，为了避免移植物排斥反应和移植物抗宿主病，本发明的方法利用了新的抗第三方Tcm细胞(如下文中的详细描述)。
[0233]根据本发明的方法，这些抗第三方Tcm细胞是在细胞或组织移植体的移植同时、之前或之后给予的。
[0234]可以通过本领域中已知的用于细胞移植的任何方法给予抗第三方Tcm细胞，例如但不限于细胞输注(例如1.V.)或通过腹膜内途径。
[0235]为了不受理论的限制，治疗有效量是足够用于免疫耐受、抗肿瘤作用和/或免疫重建而不诱导GVHD的抗第三方Tcm细胞的量。由于本发明的Tcm细胞在移植之后归巢至淋巴结，可以需要更低量的细胞(与先前使用的细胞剂量相比，参见例如W02001/049243)来达到细胞的有益效果(例如免疫耐受、抗肿瘤作用和/或免疫重建)。可以理解的是，可以需要更低水平的免疫抑制药来与本发明的Tcm细胞进行组合(例如从治疗方案中排除雷帕霉素)。
[0236]治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是在考虑到本文提供的详细公开内容的情况下。
[0237]对于在本发明的方法中使用的任何制剂，可以从体外和细胞培养测定中初步估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到所需的浓度或滴度。此类信息可以用来更准确地确定人类中的有用剂量。
[0238]例如，在组织移植的情况下，输注到接受者中的抗第三方Tcm细胞的数量应当多于IxioVKg体重。输注到接受者中的抗第三方Tcm细胞的数量通常应当在IxioVKg体重至lxl04/Kg体重的范围内、在lxl04/Kg体重至lxl05/Kg体重的范围内、在lxl04/Kg体重至lxl06/Kg体重的范围内、在lxl04/Kg体重至lxl07/Kg体重的范围内、在lxl04/Kg体重至lxl08/Kg体重的范围内、在lxl03/Kg体重至lxl05/Kg体重的范围内、在lxl04/Kg体重至lxl06/Kg体重的范围内、在lxl06/Kg体重至lxl07/Kg体重的范围内、在lxl05/Kg体重至lxl07/Kg体重的范围内、在lxl06/Kg体重至IxioVKg体重的范围内。根据具体的实施方式，输注到接受者中的抗第三方Tcm细胞的数量应当在lxl05/Kg体重至IxioVKg体重的范围内。
[0239]因此，本发明的新的抗第三方Tcm细胞可以用作细胞或组织移植用的辅助疗法(如下文中的描述)。另外，本发明的新的Tcm细胞还被赋有抗疾病活性(例如，抗肿瘤细胞活性，如下文中进一步的详细描述)，因此其本身可以用于疾病治疗。
[0240]根据具体的实施方式，为了获得移植物抗病变细胞活性(例如，抗肿瘤作用，如抗白血病治疗)，可以使用同源细胞以及非同源细胞。
[0241]因此，本发明的方法可以被应用于治疗任何疾病，例如但不限于:恶性疾病、与移植物的移植相关的疾病、感染性疾病(如病毒性疾病或细菌性疾病)、炎症性疾病和/或自身免疫性疾病。
[0242]可以使用本发明的方法进行治疗的疾病包括但不限于:恶性疾病，如白血病[例如，急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性前B细胞白血病、急性淋巴母细胞性T细胞白血病、急性-巨核细胞白血病、单核细胞白血病、急性髓系白血病、急性髓细胞性白血病、伴随嗜酸粒细胞增多的急性髓细胞性白血病(acutemyeloid with eosinophilia)、B细胞型白血病、嗜碱性粒细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性白血病、B细胞型白血病、嗜酸 性粒细胞白血病、Friend白血病、粒细胞或髓细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴细胞白血病、巨核细胞白血病、单核细胞白血病、单核细胞-巨噬细胞白血病、髓母细胞性白血病(myeloblastic)、髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病(myelomonocytic)、楽;细胞性白血病、前B细胞型白血病、早幼粒细胞白血病(piOmyelocytic)、亚急性白血病、T细胞型白血病、淋巴肿瘤、易患骨髓恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)和B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)]、淋巴瘤(例如，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胸腺淋巴瘤)、癌瘤、母细胞瘤和肉瘤；与移植物的移植相关的疾病(例如，移植物排斥反应、慢性移植物排斥反应、亚急性移植物排斥反应、超急性排斥反应、急性排斥反应和移植物抗宿主病)；感染性疾病，包括但不限于慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒性疾病(例如EBV、CMV, HIV)、细菌性疾病、原生动物传染病、寄生虫病、真菌病、支原体病和朊病毒病；炎症性疾病(例如，慢性炎性疾病和急性炎症性疾病)；和自身免疫性疾病(例如，心血管疾病、类风湿疾病、腺疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、肌肉疾病、肾病、与生殖有关的疾病、结缔组织疾病和全身性疾病)。
[0243]因此，本发明的方法可以更进一步有利地应用于在受试者中治疗疾病，同时伴随地促进与抗第三方Tcm细胞同源的细胞或组织移植体的移植(例如，在细胞或组织移植体与抗第三方细胞来源于同一供体的情况下)。
[0244]本文中使用的术语“约(about) ”是指±10%。
[0245]术语“包含(comprise)，，、“含有(comprising)”、“包括(includes) ”、“包括(including) ”、“具有(having) ”以及它们的词形变化是指“包括但不局限于”。
[0246]术语“由……组成(consisting of) ”是指“包括并限于”。
[0247]术语“基本上由......组成(consisting essentially of) ”是指组合物、方法或结
构可以包括另外的成分、步骤和/或部件，但只是在该另外的成分、步骤和/或部件不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特征的时候才可行。
[0248]本文中使用的单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“该(the) ”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物(a compound) ”或“至少一种化合物(atleast one compound) ”可以包括多种化合物,包括它们的混合物。
[0249]在整个本申请中，可以以一定范围的样式呈现本发明的各种实施方式。应当理解的是，在一定范围样式内的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应当被解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，一定范围的描述应当被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，一定范围如I至6的描述应当被视为已经具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及处于该范围内的单个数字，例如1、2、3、
4、5和6。不论范围的宽度如何，这都适用。
[0250]每当在本文中指定数值范围时，其是指包括该处于该指定范围内的任何引用的数值(分数或整数)。用语“在第一个指定数字和第二个指定数字之间的范围(ranging/ranges between a first indicate number and a second indicate number)，，和“第一个?旨定数字至第二个?旨定数字白勺范围(ranging/ranges from a first indicate numberto a second indicate number) ”在本文中可互换使用并且是指包括第一和第二指定数字以及它们之间的所有分数和整数数字。
[0251]本文中使用的术语“方法(method) ”是指用于完全给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于已经为化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者所公知的或者可以容易地从已知的方式、手段、技术和步骤开发出的那些方式、手段、技术和步骤。
[0252]可以理解的是，为了清楚起见而在分开的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为了简便起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以分开地或以任何适合的子组合或适合地在本发明的其他实施方式中提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方式在没有那些元素的条件下不起作用。
[0253]上文描绘的以及如下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面都能够在以下实施例中找到支持。
[0254]实施例
[0255]现在参考下面的实施例，其与上述说明一起以非限制性的方式阐明本发明。
[0256] 一般地，本文中使用的命名以及本发明中利用的实验步骤包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。些技术在文献中进行了充分说明。参见，例如，〃MolecularCloning:A laboratory Manual〃Sambrook等，(1989) ；^Current Protocols in MolecularBiology"卷 1-1II Ausubel, R.M.,编(1994) ；Ausubel 等，"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley 和 Sons,Baltimore, Maryland(1989) ;Perbal, 〃APractical Guide to Molecular Cloning", John ffiley&Sons, New York(1988) ；ffatson等，"Recombinant DNA^, Scientific American Books, New York ;Birren 等(编)"GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series",卷 1-4，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York (1998);美国专利号 US4, 666，828、US4, 683，202、US4, 801，531、US5, 192，659 和 US5, 272，057 阐述的方法-/Xell Biology:A Laboratory Handbook",卷 1-1II Cellis, J.E.,编(1994) ,Current Protocols in Immunology^ 卷 1-1IIColigan J.E.,编(1994) ；Stites 等(编)，"Basic and Clinical Immunology"(第8 版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT (1994) ；MishelI 和 Shiigi(编)，"SelectedMethods in Cellular Immunology", W.H.Freeman 和 C0.，New York(1980);可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如美国专利号3，791,932、US3, 839, 153、US3, 850，752、US3, 850，578、US3, 853，987、US3, 867，517、US3, 879，262、US3, 901，654、US3, 935，074、US3, 984，533、US3, 996，345、US4, 034，074、US4, 098，876、US4, 879，219、US5, 011,771 和 US5, 281，521 !"Oligonucleotide Synthesis^Gait, M.J.,编(1984) ；uNucleic Acid Hybridization^Hames, B.D.和 Higgins S.J.,编(1985)；"Transcription and Transiation^Hames, B.D.和 Higgins S.J.,编(1984) ;〃AnimalCell Culture〃Freshney, R.1.，编(1986) ,Immobilized Cells and Enzymes^IRLPress, (1986) ;"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B.，(1984)和"Methods in Enzymology^ 卷 1-317，Academic Press ;"PCR Protocols: A GuideTo Methods And Applications^,Academic Press,San Diego,CA (1990) ；Marshak等,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual〃CSHL Press (1996);所有这些文献都通过引用并入，如同在本文中完全阐述一样。在该文件中提供了其他的一般的参考文献。相信其中的步骤在本领域中是众所周知的并且为读者提供了方便。其中包含的所有信息均通过引用并入。
[0257]通用的材料和 实验步骤
[0258]外周血单核细胞(PBMC)
[0259]通过Ficoll密度梯度离心从患者和健康志愿者的全血中分离出PBMC。当标示时，细胞类型通过先前描述的血清学方法定为I类HLA[组织分型技术手册(Manual of TissueTyping Techniques).Washington DC, National Institute of Allergy and InfectiousDiseases, NIH DHEff Publication76_545，1976，第 22 页]。
[0260]肿瘤细胞系
[0261]使用H.My2ClR HLA A2K66A转染子细胞和H.My2ClR HLA A2w.t.转染子B细胞系。
[0262]使用C1R，其为一种缺乏表面HLA A和B抗原的人类B细胞淋巴母细胞系，如先前所描述的其通过Y射线照射并随后通过选择I类单克隆抗体和补体而来源于Hmy.2B-LCL[Storkus WJ,等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1989) 86:2361-2364]。
[0263]使用了 CIR-neo，如先前所描述的，其为在1987年通过使用经修饰的新霉素耐药性真核表达载体pSP65-Neo (该载体没有携带插入物)电穿孔ClR细胞系而建立的一种稳定转染子细胞系[Grumet FC,等，Hum.1mmunol.(1994) 40:228-234] ?
[0264]树突状细胞产生
[0265]使用3ml补充有I %人血清和青霉素/链霉素加GM-CSF (800IU/ml)和IL-4 (20ng/ml)的Cellgro DC培养基(Peprotech, Hamburg, Germany)在6孔板中通过塑料贴壁培养分离出单核细胞。培养48小时后，加入1.5ml的培养基(1600IU/ml的+GM-CSF和20ng/ml的IL4)。24小时后，收获非贴壁细胞并且对大细胞进行计数(大多数为未成熟 DC)，重悬于含有 GM-CSF800IU/ml、IL_420ng/ml、10ng/ml 来自大肠杆菌 055: B5 的LPS (Sigma, Deisenhofen, Germany)和 IFNy (Peprotech, 100IU/ml)的新鲜培养基中，并且以约106DC每孔接种在2ml中并且孵育过夜。第二天，弃去非贴壁细胞，并且在冰上孵育20分钟后使用冷的PBS/1 % HS温和地取下贴壁DC。对由成熟DC组成的大细胞进行计数。用30Gy辐射细胞以避免生长(outgrowth)少数潜在的NK-细胞或记忆T细胞的污染，然后用于T细胞刺激。
[0266]从PBMC中分离幼稚⑶8T细胞
[0267]使用⑶8阴性选择试剂盒(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)根据制造商的说明通过对幼稚CD8T细胞进行初步阴性选择分离幼稚CD8T细胞。随后使用CD45R0-珠并在LD柱上耗尽经历过抗原的⑶8+T-细胞。
[0268]产生抗第3方中央型记忆人⑶8T细胞
[0269]分离出幼稚CD8T细胞并且将其重悬在补充有IL-21 (Peprotech, 30ng/ml)的T细胞培养基中。将经辐射的DC以1:4DC:T-细胞比率以4xl05个T-细胞每孔加入到48孔板中。每个孔的总体积为500 μ I。
[0270]在初步培养72小时后，加入500 μ I含有IL-7和IL-15 (Peprotech, 5ng/ml终浓度)的T细胞培养基，并且如结果部分中概述的，随后每2-3天喂养一次细胞。
[0271]GVL 检测
[0272]通过Ficoll 密度梯度离心获得 H.My ClR(〃Neo〃)和 H.My ClR HLAA2K66A 突变体转染子(〃K66A〃)B淋巴母细胞系，并且使用0.15μ g/ml钙黄绿素AM (MolecularProbes, Inc, Eugene, OR)( 一种细胞死亡时被释放的活体染料)根据制造商的说明进行标记。随后，在24孔板中，以有利于抗第3方Tcm的I至5的比率、在存在或不存在抗第3方Tcm的条件下，孵育2xl05个钙黄绿素标记的B淋巴母细胞系的细胞22小时。在共同培养之前，通过阴性选择试剂盒(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)对抗第3方Tcm富集⑶8+T细胞。未向MLR中加入外源性细胞因子。回收细胞并且通过FACS通过测量幸存的钙黄绿素染色的B淋巴母细胞系的细胞的数量来分析存活率。为了检测由膜联蛋白V+的细胞凋亡，用5μ I膜联蛋白V-APC(BD)在室温下孵育样品15分钟。随后，洗去未结合的膜联蛋白V，并且通过FACS分析样品。为了获得细胞绝对值，将样品悬浮于恒定体积中并且在恒定预定的时间段内获得每个样品的流式细胞计数，并且与用固定体积和固定进料细胞数量获得的流式细胞计数进行比较。存活率表示相对于单独的B淋巴母细胞系的细胞的存活。
[0273]通过以下公式来计算B淋巴母细胞系细胞杀灭的百分比:
[0274]
f 评估孔屮活B淋巴母细胞系细ft的数
I —对照孔中活B淋巴母细胞系细胞的数:bJx
[0275]通过以下公式来计算经历了特定的凋亡的B淋巴母细胞系细胞的百分比:=(评估孔中的％钙黄绿素+膜联蛋白V+B淋巴母细胞系细胞)-(对照孔中的％钙黄绿素+膜联蛋白V+B淋巴母细胞系细胞)。
[0276]基于CD137活化标志物的用于耗尽同种异体反应性的两阶段磁力分选方法
[0277]在IL_21(P印rotech, 30ng/ml)的存在下，以6:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞。活化14小时后，通过磁力分选(Miltenyi，BergischGladbach, Germany)阳性选择⑶ 137+细胞。然后在 IL-21 (Peprotech, 30ng/ml)的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC再刺激⑶137+细胞直至第3天。此后，使用5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15 (Peprotech)扩增细胞直至第10天。在第10天,将细胞分成两个测试组。在第一组中，用IL-7和IL-15继续扩增细胞直至第14天，而在IL-7和IL-15(以1-2的比率)的存在下用经辐射的宿主PBMC来活化第二测试组中的细胞。24小时后，通过磁力分选来耗尽⑶137+细胞。用IL-7和IL-15再接种⑶137耗尽的细胞并且培养直至第14天(“抗第三方⑶137+和抗宿主⑶137-”)。在第14天，通过CFSE检测针对第三方或经辐射的宿主PBMC来评价抗第3方和抗宿主的同种异体反应性。对于CFSE检测，在IL-7的存在下，在有或没有2xl06个经辐射的(20gy)PBMC刺激子的存在下孵育IxIO6CFSE+应答子84小时。84小时之后，回收细胞并且由FACS通过测量CFSE低染色的CD8T细胞(CD3+CD8+CD56-)的数量来分析细胞分裂。为了获得细胞绝对值，将样品悬浮在恒定体积中并且在恒定预定的时间段内获得每个样品的流式细胞计数。具体的分裂细胞的数量=(具有APC的分裂细胞的数量)-(不具有APC的分裂细胞的数量)。负值表示响应于用宿主PBMC活化的分裂细胞的数量甚至低于未用任何活化的分裂细胞的数量。
[0278]实施例1
[0279]产生并优化人抗第三方T中央型记忆(Tcm)细胞的
[0280]为了将先前提出的小鼠研究转化为临床应用，优化步骤以产生人抗第3方细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。为此，评价了不同的参数，包括用于分离CD8应答细胞的不同的试剂、刺激子的组成以及细胞因子环境(milieu)。
[0281]潜在地，如在先前提出的小鼠模型中发现的，在自体的背景中[Lask A等，Blood(ASH年会摘要)，(2010) 116:424]或在同种异体骨髓移植中(BMT)[Ophir E 等,Blood.(2010) 115 (10): 2095-104 ；0phir Ε.，第 37 次 EBMT 年会，4 月3-6, 2011, Paris, France.口头报告摘要Nr:662]，用中央型记忆T细胞(Tcm)的治疗可能是有价值的。
[0282]在人类自体设置中(图1A)，抗第3方Tcm可以与自体BMT—同给予。分离出患者自身的CD8+T细胞并且针对来自同种异体供体的同种异体树突状细胞进行刺激。
[0283]在人类同种异体设置中(图1B)，抗第3方Tcm可以与同种异体T耗尽的BM细胞一起移植。将来源于同种异体BM供体的幼稚CD8+T细胞用作应答子并且将第3方供体树突状细胞作刺激子以使得能够产生宿主非反应性Tcm。为了避免GVHD，选择第3方供体以确保他的HLA-1类等位基因与宿主的HLA-1类等位基因是共用的。
[0284]而在小鼠和人类中，基本的预想方案类似地包含人⑶8T细胞分离，随后通过针对第3方细胞进行刺激(图1A-B和图2A-B)，在人类方案中必须修改若干其他参数，如下表1中所示的。
[0285]考虑到自体Tcm不存在GVHD风险，产生方案的优化主要集中在实现具有中央型记忆表型的抗第3方CD8T细胞的有效扩增。
[0286]如可以从图3A中看到的，基于以下三个主要步骤开发了新的方案:a)从PBMC中选择CD8T细胞；b)在IL-21的存在下，针对同种异体树突状细胞(DC)刺激3天；和c)在无抗原的环境中用IL-7、IL-15和IL-21扩增另外的8天。[0287]因此，在这种新开发的方案中，多个参数都与用于产生小鼠Tcm的参数不同(表1和图3A-B)。主要差异涉及用于应答子和刺激子的组织的来源(PBMC相对于脾细胞)、刺激子(树突状细胞相对于脾细胞)、以及细胞因子的组成。
[0288]表1:用于产生Tcm的自体人类方案与同源小鼠方案的比较
【权利要求】
1.一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，所述细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，所述方法包括: (a)在IL-21的存在下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以便富集抗原反应性细胞；和 (b)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(a)的所述细胞，以便允许增殖包含所述中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞，从而产生所述细胞的分尚群体。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括:在步骤(a)之前，从所述PBMC中耗尽非贴壁细胞。
3.根据权利要求1或2所述 的方法，进一步包括:在步骤(a)之前，从所述PBMC中耗尽⑶4+和/或⑶56+细胞。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，进一步包括:在步骤(a)之前，从所述PBMC中选择CD45RA+和/或CD45R0-细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PBMC包含⑶8+T细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括:在步骤(a)之后且在步骤(b)之前，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用一种或多种第三方抗原培养获自步骤(a)的所述细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种第三方抗原包括树突状细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述树突状细胞是经辐射的树突状细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种第三方抗原选自由以下组成的组:第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质以及由自体呈递细胞、非自体呈递细胞呈递的或在人工载体或人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第三方细胞是选自由以下组成的组的刺激细胞:纯化自外周血淋巴细胞、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞和人工抗原呈递细胞的细胞。
11.一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，所述细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有移植物抗白血病(GVL)活性，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，所述方法包括: (a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁外周血单核细胞(PBMC)，以便获得⑶8+T细胞； (b)在IL-21的存在下，使所述CD8+T细胞与第三方树突状细胞接触12小时至5天，以便允许富集抗原反应性细胞； (c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用所述第三方树突状细胞培养获自步骤(b)的细胞12小时至3天；和 (d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养由步骤(c)获得的所述细胞5至20天，以便允许增殖包含所述中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞，从而产生所述细胞的分离群体。
12.—种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三细胞的细胞的分离群体的方法，所述细胞赋有抗疾病活性并且在移植之后能够归巢至淋巴结，所述方法包括: (a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁外周血单核细胞(PBMC)，以便获得⑶8+T细胞； (b)在IL-21的存在下，使所述CD8+T细胞与非同源的树突状细胞接触12小时至5天，以便允许富集抗原反应性细胞； (c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用所述非同源的树突状细胞培养获自步骤(b)的所述细胞12小时至3天；和 (d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(c)的所述细胞5至20天，以便允许增殖包含所述中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞，从而产生所述细胞的分离群体。
13.根据权利要求11或12所述的方法，进一步包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前从所述PBMC中选择⑶45RA+和/或⑶45RO-细胞。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述CD8+T细胞包含幼稚CD8+T细胞。
15.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述树突状细胞包括体外扩增的树突状细胞。
16.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述树突状细胞包括经辐射的树突状细胞。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述IL-21的存在下的所述接触进行12小时至5天。
18.根据权利要求1、11或12所述的方法，其中，在所述IL-21的存在下的所述接触进行2至3天。
19.根据权利要求1、11或12所述的方法，其中，在所述IL-21的存在下的所述接触进行3天。
20.根据权利要求1所述的方法，进一步包括:在步骤(a)之后且在步骤(b)之前选择经活化的细胞。
21.根据权利要求11所述的方法，进一步包括:在步骤(b)之后且在步骤(c)之前，选择经活化的细胞。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述选择经活化的细胞是通过选择⑶137+和/或⑶25+细胞来进行的。
23.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述选择经活化的细胞在所述接触之后进行12至72小时。
24.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述IL-21、IL-15和IL-17的存在下，用所述一种或多种第三方抗原的所述培养进行12小时至3天。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述无抗原的环境中，在所述IL-21、IL-15和IL-7的存在下的所述培养进行5至20天。
26.根据权利要求1、11或12所述的方法，其中，在所述无抗原的环境中，在所述IL-21、IL-15和IL-7的存在下的所述培养进行7至11天。
27.根据权利要求1 所述的方法，进一步包括:在步聚(b)之后，耗尽同种异体反应性细胞。
28.根据权利要求11所述的方法，进一步包括:在步聚(d)之后，耗尽同种异体反应性细胞。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述耗尽所述同种异体反应性细胞是在使所述包含所述中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)的细胞与宿主抗原呈递细胞(APC)接触之后通过耗尽⑶137+和/或⑶25+细胞来进行的。
30.根据权利要求1或12所述的方法，其中，所述外周血单核细胞(PBMC)相对于受试者是同源的。
31.根据权利要求1或11所述的方法，其中，所述外周血单核细胞(PBMC)相对于受试者是非同源的。
32.根据权利要求11或31所述的方法，其中所述非同源的PBMC相对于受试者是异种的或同种异体的。
33.根据权利要求1、11或12所述的方法，其中，所述具有T中央型记忆表型的抗第三方细胞包含 CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA' CD45RO+ 标记。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述细胞的分离群体的至少50%是CD3+CD8+细胞，所述⑶3+⑶8+细胞的至少50%具有所述标记。
35.一种包含具有中央型记忆T细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，其中，所述细胞的分离群体的至少50%是⑶3+⑶8+细胞，所述⑶3+⑶8+细胞的至少50%包含⑶3+、⑶8+、⑶62L+ 、⑶45RA_、⑶45RO+标记，并且进一步地，其中所述细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性，并且在移植后能够归巢至淋巴结。
36.一种根据权利要求1至34的方法产生的包含具有中央型记忆T细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，所述细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性，并且在移植后能够归巢至淋巴结。
37.一种在需要其的受试者中治疗疾病的方法，其中，所述疾病选自由恶性疾病、病毒性疾病和自身免疫性疾病所组成的组，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求35或权利要求36所述的细胞的分离群体，从而治疗所述受试者。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述恶性疾病包括白血病或淋巴瘤。
39.根据权利要求37所述的方法，其中，所述细胞的分离群体与所述受试者是同源的。
40.根据权利要求37所述的方法，其中，所述细胞的分离群体与所述受试者是非同源的。
41.一种治疗需要细胞或组织移植的受试者的方法，所述方法包括: (a)将细胞或组织移植体移植至所述受试者中；和 (b)向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求35或权利要求36所述的细胞的分离群体，从而治疗所述受试者。
42.根据权利要求41所述的方法，进一步包括，在所述移植之前在亚致死、致死或超致死的条件下调理所述受试者。
43.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体与所述受试者是同源的。
44.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体来源于选自由HLA相同的同种异型供体、HLA不相同的同种异型供体和异种供体组成的组的供体。
45.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体包含未成熟的造血细胞。
46.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体选自由肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、皮肤、肠和淋巴/造血组织或器官所组成的组。
47.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体包括联合移植的多个器官。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述联合移植包括移植未成熟的造血细胞和实体器官。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述未成熟的造血细胞和所述实体器官获自同一供体。
50.根据权利要求48所述的方法，其中，所述未成熟的造血细胞是在所述实体器官的所述移植之前、同时或之后移植的。
51.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞的分离群体是在所述细胞或组织移植之前、同时或之后给予的。
52.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞的分离群体与所述受试者是同源的。
53.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞的分离群体与所述受试者是非同源的。
54.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体以及所述细胞的分离群体来源于同一供体。
55.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体与所述受试者是同源的而所述细胞的分离群体与所述受试者是非同源的。
56.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞或组织移植体与所述受试者是同源的并且所述细胞的分离群体与所述受试者是同源的。
57.一种治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法，所述方法包括: (a)将未成熟的造血细胞移植至所述受试者中；和 (b)向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求35或权利要求36所述的细胞的分离群体，从而治疗所述受试者。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述细胞的分离群体是在所述未成熟的造血细胞之前、同时或之后给予的。
59.根据权利要求57所述的方法，其中，所述未成熟的造血细胞和所述细胞的分离群体来源于同一供体。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述供体与所述受试者是非同源的。
61.根据权利要求57所述的方法，其中，所述未成熟的造血细胞和所述细胞的分离群体来源于所述受试者。
62.根据权利要求57所述的方法，进一步包括，在所述移植之前在亚致死、致死或超致死的条件下调理所述受试者。
63.根据权利要求37、41或57所述的方法，其中，所述受试者是人类受试者。
【文档编号】A61K39/00GK103930130SQ201280054739
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2011年9月8日
【发明者】亚伊尔·赖斯纳, 亚基·艾德尔斯坦, 埃兰·奥菲尔, 阿萨夫·拉斯克, 兰·阿菲克, 诺加·奥-杰瓦, 埃丝特·巴卡尔-卢斯蒂格 申请人:耶达研究及发展有限公司