本发明属于医学技术领域，具体涉及一种体外培养胎膜间充质干细胞的方法。
背景技术：
未足月胎膜早破(pretermprematureruptureofmembranes，pprom)是指妊娠37周内临产前发生的自发性胎膜破裂。妊娠满37周后的胎膜早破发生率为10%，妊娠不满37周的胎膜早破即未足月胎膜早破发生率为2.0～3.5%，不满28周发生的中期胎膜早破发生率为0.4%–0.7%。尽管现如今医学条件下极早产儿存活率已有明显改善，但总体存活率仍较低，普遍伴有短期及远期身体发育异常，经济耗费极高。改善未足月胎膜早破孕妇妊娠结局是临床热点，修复胎膜破口更是世界难题。
治疗pprom的理想方法为羊膜腔封闭疗法，使羊膜腔重新处于封闭状态，既降低孕妇羊膜腔感染率，又可使羊水量逐渐增加并恢复正常，减少由于羊水过少而导致的婴儿发育迟缓与畸形。
目前采用的封闭材料主要有：
①纤维蛋白胶：天然高分子材料，取自哺乳动物牛和人的血清。纤维蛋白胶能够模拟凝血链的最后一个步骤，形成一个半硬式的纤维素凝块，羊膜腔呈现功能性封闭，而非解剖学封闭。
②羊膜补片：体外构建的纤维蛋白支架，主要成分是血小板和冷沉淀物，羊膜破口暴露的纤维组织可激发血小板的聚集、粘附和活化，局部形成栓子堵塞破口。其作用机制认为是血小板与胶原泥、纤维蛋白胶的混合物可形成一种生理性栓塞粘附在绒毛膜蜕膜的基底面并形成一种促进愈合的混合物，临床实验证明羊膜腔内注射可有效地治疗医源pprom，而对于自发性pprom效果还不明确。
③明胶海绵：，有学者在宫颈环扎术的基础上实行栓塞治疗，提高了疗效。体外实验发现明胶海绵栓可封闭<7mm的胎膜破口。
④胶原栓：与纤维蛋白胶类似的一种天然高分子材料，局部形成胶原纤维可封闭缺损组织，胶原栓和基质补片用于治疗医源性pprom的疗效也已得到了动物模型实验的证实。
⑤生物膜：有部分文章报道新型生物膜，但属个案，仅限于体外实验，相关研究仍较少
目前，采用的封闭方式主要有：
①宫颈注射：一般选用纤维蛋白胶。baumgarten经宫颈注射纤维蛋白胶并配以宫颈环扎术治疗26例26-33周患者，孕期延长3-172天，17例获活婴。
②经羊膜腔注射：quincy注射血小板和冷沉淀治疗了7例医源性早破患者，孕龄16-20周，其中4例患者羊膜腔重新封闭，羊水渗漏停止，羊水指数不同程度增加，2例妊娠至足月，4例获健康活婴，但羊膜补片却未能封闭自发性胎膜早破患者。
③经胎儿镜注射：young为一名继发于羊膜腔穿刺术后的患者施行了胎儿镜下羊膜腔封闭术，术时孕龄20周。准确定位胎膜破口部位后在该部位注射孕妇自体血小板、纤维蛋白胶，术后羊水渗漏停止。
目前存在的问题：如封闭材料的副反应，封闭材料作为一种异源性物质，纤维蛋白胶的化学成分及牛血清可增加宫内感染的几率；羊膜补片所采用的异体血小板存在异源性反应的危险，而自供体法程序繁杂，费用昂贵，限制了临床使用。此外包括纤维蛋白胶、明胶海绵在内的封闭材料都存在被胎儿误吸，影响吞咽，造成胎儿发育不良的危险。在注射途径方面，需要一种创伤更小且暴露清楚胎膜破口部位的注射方法。封闭性能方便更希望达到解剖学封闭效果。
间充质干细胞修复胎膜早破技术是一项新兴的技术，间充质干细胞的生物学特性：间充质干细胞(msc)是一种具有自我更新、多向分化潜能的成体干细胞。msc源于发育早期的中胚层，属于非终末分化细胞。其来源丰富，可取源于骨髓、脐带血、脂肪、胎盘⋯等多种组织。它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。此外，它还有组织修复以及免疫抑制的特性。
间充质干细胞由于其可多向分化为目的细胞、分泌细胞因子促进组织修复；免疫调节及支持造血的特性应用于多种疾病的治疗。随着再生医学的发展和对间充质干细胞生物学特性的深入研究，msc作为种子细胞被广泛的应用于损伤修复。大量动物实验和前期临床试验表明，msc可通过定向分化替代变性或缺失的多巴胺能神经元以及分泌各种具有神经营养、抗细胞凋亡、抗炎效应的生物活性因子改善帕金森病的症状。还有动物实验研究表明，msc有促进造血的功能。胎盘间充质干具有更低的免疫原性，不引起免疫排斥，还具有免疫调控的作用。
目前，现有技术中急需一种体外培养胎膜间充质干细胞的方法。
技术实现要素：
本发明提供一种体外培养胎膜间充质干细胞的方法。
其技术方案为：
一种体外培养胎膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1、人胎膜标本的采集和模型建立：
获取足月产健康胎儿的人胎膜，无菌组织钳剥离母蜕膜，切割方形样品，放置在24孔板中，样品用3毫升3ml的70%乙醇在蒸馏水中孵育消毒，然后将样品用磷酸盐缓冲盐水（pbs）洗涤三次，并内径为1厘米金属环固定到井底，以形成用于细胞接种的培养井。
步骤2、胎膜间充质干细胞移植
在每层膜上用5ml的dmem培养基接种msc，37℃，5%co2下，培养2小时后，以允许细胞附着，除去金属环，并将2ml的dmem添加到培养条件中，并每周改变三次。以5x106／ml的细胞密度在adm表面均匀滴加干细胞悬液至表面充满液体为止，1小时后再种植，连续种植3次，种植完毕1小时后加入足量amino．maxii培养基+20％fbs，置于标准孵育箱中培养3天。
步骤3、胎膜间充质干细胞制备。
进一步，步骤1中，所述方形样品的边长为1.5～1.5厘米。
进一步，步骤1中，建立的模型包括：模型1：低浓度和高浓度mmp-9分别处理12个样品；模型2:7号和9号针头分别处理12个样品。
进一步，步骤3具体为：
收集：用含200u／ml双抗(青霉素和链霉素)的生理盐水洗涤人胎膜，并洗涤组织表面凝固的血块，连续洗涤三次，直至人胎膜表面未见明显血凝块，洗涤液较清澈。用组织剪将将人胎膜剪成小块组织，大小约为lcmxlcm。夹取剪碎的小块人胎膜，放入50ml离心管，每管装约15-20ml人胎膜。
培养：每管胎膜加入10ml0．1％中性蛋白酶，置于37℃处理10-15分钟，吸取细胞悬液，加入足量0．25％胰酶及0．02％edta溶液继续消化20分钟，连续消化4次，收集所有细胞悬液，1200rpm离心5分钟，用含200u／m1双抗的pbs洗涤两次，加入amino—max1i培养基，置于标准孵育箱培养。按常规方法传代。
鉴定：收集第5代单细胞悬液，根据细胞数量加入饱和浓度的pe或fitc标记的抗体cd34、cd45、cd73、cd90，4℃避光孵育30--50分钟，pbs洗涤2次,以洗去未标记抗体；4％多聚甲醛同定；用bdvantage流式细胞仪检测。
本发明的有益效果：
以往采用机械封堵的材料效果不佳，没有得到广泛应用。本发明采用最先进的干细胞技术，采用生物膜封堵胎膜破口，效果更明显，更有利于临床推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
一种体外培养胎膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1、人胎膜标本的采集和模型建立：
获取足月产健康胎儿的人胎膜，无菌组织钳剥离母蜕膜，切割方形样品（1.5～1.5厘米），放置在24孔板中，样品用3毫升3ml的70%乙醇在蒸馏水中孵育消毒，然后将样品用磷酸盐缓冲盐水（pbs）洗涤三次，并内径为1厘米金属环固定到井底，以形成用于细胞接种的培养井。
模型1：低浓度和高浓度mmp-9分别处理12个样品；
模型2:7号和9号针头分别处理12个样品。
步骤2、胎膜间充质干细胞移植
在每层膜上用5ml的dmem培养基接种msc，培养2小时后（37℃，5%co2）以允许细胞附着，除去金属环，并将2ml的dmem添加到培养条件中，并每周改变三次。以5x106／ml的细胞密度在adm表面均匀滴加干细胞悬液至表面充满液体为止，1小时后再种植，连续种植3次，种植完毕1小时后加入足量amino．maxii培养基+20％fbs，置于标准孵育箱中培养3天。
步骤3、胎膜间充质干细胞制备：
收集：用含200u／ml双抗(青霉素和链霉素)的生理盐水洗涤人胎膜，并洗涤组织表面凝固的血块，连续洗涤三次，直至人胎膜表面未见明显血凝块，洗涤液较清澈。用组织剪将将人胎膜剪成小块组织，大小约为lcmxlcm。夹取剪碎的小块人胎膜，放入50ml离心管，每管装约15-20ml人胎膜。
培养：每管胎膜加入10ml0．1％中性蛋白酶，置于37℃处理10-15分钟，吸取细胞悬液，加入足量0．25％胰酶一0．02％edta溶液继续消化20分钟，连续消化4次，收集所有细胞悬液，1200rpm离心5分钟，用含200u／m1双抗的pbs洗涤两次，加入amino—max1i培养基，置于标准孵育箱培养。按常规方法传代。
鉴定：收集第5代单细胞悬液，根据细胞数量加入饱和浓度的pe或fitc标记的抗体cd34、cd45、cd73、cd90，4℃避光孵育30--50分钟，pbs洗涤2次,以洗去未标记抗体；4％多聚甲醛同定；用bdvantage流式细胞仪检测。
(人胎膜来源的贴壁细胞表达间充质干细胞表面标志物cd73、cd90，不表达造血细胞表面标志物cd34、cd45，表明该细胞为间充质干细胞。)
结果：
培养24小时后检查见胎膜破口封闭。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。