一种间充质干细胞无血清培养基的制作方法

本发明涉及细胞培养的技术领域，尤其是一种间充质干细胞无血清培养基。

背景技术：

间充质干细胞(msc)是中胚层来源的具有自我复制、多向分化和免疫调节功能的多能干细胞。msc具有低免疫原性的特性，所以可以逃避t细胞的识别。此外msc可抑制il-2介导的nk细胞活化，从而达到免疫耐受，避免迟发性移植物宿主反应。msc可通过分泌细胞因子，改变组织微环境，促进损伤修复。近年来，msc在临床上得到了广泛的应用，在治疗白血病等恶性血液病、再生障碍性贫血、难治疗性免疫缺陷病、某些遗传性疾病以及组织器官损伤修复等多种疾病具备显著的疗效。干细胞的作用机制主要是通过抑制细胞死亡、促进细胞分化、增殖从而实现受损组织的修复。

用于临床的间充质干细胞主要来自骨髓、脐带、脂肪和干细胞动员后的外周血。由于脐带为医疗废弃物，因此来源丰富取材方便。且对供者无不利影响，无伦理问题的限制。脐带中的间充质干细胞含量丰富，未分化程度高，因此分化能力强且更利于在体外培养扩增，可为实验和临床提供充足的细胞来源。

间充质干细胞在组织中的含量极低，给干细胞研究和应用带来了限制。如何获得大量高纯度和高活性的间充质干细胞，是相当重要的课题。国际干细胞治疗学会提出了鉴定人源间充质干细胞3条标准：1)在标准培养条件下间充质干细胞具备对塑料底物的贴附性；2)间充质干细胞群体表达cd105、cd73及cd90，而不表达造血标志物cd45和cd34；3)经体外诱导间充质干细胞能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。根据干细胞的这些特性，分离纯化以及培养扩增间充质干细胞。

目前国内外并没有一个得到公认的、方便实用的间充质干细胞的培养方法。大多数仍采用添加胎牛血清(fbs)的培养基进行间充质干细胞培养。但是这种添加的异种血清可能会携带细菌、病毒等，存在着诸多安全隐患。异种血清带来的异源性蛋白，容易引起人体的过敏反应。有研究表明，msc在体外培养过程中会吞噬培养基中的蛋白，因此含有胎牛血清的培养基，可使msc细胞中含有牛血清蛋白，会使受者引起免疫反应。这些问题的存在，使人们限制了使用血清等添加物来培养间充质干细胞在临床中的应用。

为解决培养基中的动物源性成分，有研究采用人血清、脐血清、富血小板血浆、血小板裂解液等来替代胎牛血清。这些动物血清替代物的主要作用是给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，虽然避免了动物性异源蛋白引入间充质干细胞。但是这些替代物同样存在一些缺点：首先是这些替代物成分不明确、血液制品具有批间差异，不稳定，且受供者年龄等影响；其次是血液制品也存在传染病和未知疾病检的潜在风险；另外人血液来源有限，限制了大规模间充质干细胞培养制备，不利于实际临床应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种间充质干细胞无血清培养基，旨在解决现有技术中缺乏一种便于大规模培养制备间充质干细胞的培养基的问题。

本发明是这样实现的，一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加物，所述添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。

进一步地，所述氨基酸包括l-酪氨酸(40mg/l)、l-胱氨酸(20mg/l)、甘氨酸(10mg/l)、l-缬氨酸(70mg/l)、l-色氨酸(20mg/l)、l-苯丙氨酸(50mg/l)、l-丝氨酸(50mg/l)、l-苏氨酸(75mg/l)、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(500mg/l)和l-甘氨酰-l-谷氨酰胺(500mg/l)。

进一步地，所述缓冲剂包括l-磷酸甘油二钠盐水合物(1.5g/l)以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1.2g/l)。

进一步地，所述白蛋白的浓度为：2g/l。

进一步地，所述其他蛋白为holotransferrin(人全铁转铁蛋白)。

进一步地，所述营养因子包括cholesterol(胆固醇)、egf以及bfgf。

进一步地，所述holotransferrin(人全铁转铁蛋白)的浓度为2-8mg/l。

进一步地，所述cholesterol(胆固醇)的浓度为0.05-0.2mg/l，所述egf的浓度为0.001mg/l，所述bfgf的浓度为0.001mg/l。

进一步地，所述基础培养基为dmem。

与现有技术相比，本发明提供的一种间充质干细胞无血清培养基，具有以下优点：

(1)、无血清培养基不含动物血清或其他异源性蛋白，减少了细胞制剂被污染的危险。在无血清培养基中添加了特定的营养因子，提高了细胞扩增效率并保持了干细胞的生物特性，增加了间充质干细胞的活率，确保了细胞的质量达到临床应用标准。

(2)、市场上现有的以lonza为代表的无血清培养基，主要被国外公司垄断，价格高，且经常会出现供货不及时的状况。而本发明配置的无血清培养基，在细胞培养效果上能达到进口水平，基础培养基来源充足不受市场影响，解决了这一问题。

(3)、简化细胞分离步骤，组织消化后的细胞即可直接用于原代培养，并保证培养细胞的专一性。

(4)、使用本发明的培养基，细胞保持良好的贴壁性，呈现出梭形的成纤维细胞形态，同时经多代培养后，细胞仍可保持正常状态；细胞生长曲线说明，细胞维持高扩增效率；细胞免疫表型分析说明，cd29、cd73、cd90和cd105阳性表达物达95％以上；而cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr等阴性表达物检测显示在2％以下，达到临床应用水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的使用间充质干细胞无血清培养基培养的间充质干细胞形态观测结果图；

图2是本发明实施例提供的使用间充质干细胞无血清培养基培养的间充质干细胞的生长曲线图；

图3是本发明实施例提供的使用间充质干细胞无血清培养基培养的间充质干细胞的细胞免疫检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。

参照图1-3所示，为本发明提供较佳实施例。

本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，该培养基包括基础培养基和添加物。基础培养基为dmem，添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。

氨基酸包括l-酪氨酸、l-胱氨酸、甘氨酸、l-缬氨酸、l-色氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺和l-甘氨酰-l-谷氨酰胺。

缓冲剂包括l-磷酸甘油二钠盐水合物以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

其他蛋白包括holotransferrin(人全铁转铁蛋白)，营养因子包括cholesterol(胆固醇)、egf以及bfgf。

这些添加物的优选浓度为：holotransferrin2-8mg/l、cholesterol0.05-0.2mg/l、egf0.001mg/l以及bfgf0.001mg/l。

本发明提供的一种间充质干细胞无血清培养基，具有以下优点：

(1)、无血清培养基不含动物血清或其他异源性蛋白，减少了细胞制剂被污染的危险。在无血清培养基中添加了特定的营养因子，提高了细胞扩增效率并保持了干细胞的生物特性，增加了间充质干细胞的活率，确保了细胞的质量达到临床应用标准。

(2)、市场上现有的以lonza为代表的无血清培养基，主要被国外公司垄断，价格高，且经常会出现供货不及时的状况。而本发明配置的无血清培养基，在细胞培养效果上能达到进口水平，基础培养基来源充足不受市场影响，解决了这一问题。

(3)、简化细胞分离步骤，组织消化后的细胞即可直接用于原代培养，并保证培养细胞的专一性。

(4)、使用本发明的培养基，细胞保持良好的贴壁性，呈现出梭形的成纤维细胞形态，同时经多代培养后，细胞仍可保持正常状态；细胞生长曲线说明，细胞维持高扩增效率；细胞免疫表型分析说明，cd29、cd73、cd90和cd105阳性表达物达95％以上；而cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr等阴性表达物检测显示在2％以下，达到临床应用水平。

以下为本发明提供的具体实施例：

间充质干细胞无血清培养基包括基础培养基和添加物。基础培养基为dmem，添加物包括氨基酸、缓冲剂、白蛋白、其他蛋白以及营养因子。

氨基酸包括l-酪氨酸(40mg/l)、l-胱氨酸(20mg/l)、甘氨酸(10mg/l)、l-缬氨酸(70mg/l)、l-色氨酸(20mg/l)、l-苯丙氨酸(50mg/l)、l-丝氨酸(50mg/l)、l-苏氨酸(75mg/l)、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(500mg/l)和l-甘氨酰-l-谷氨酰胺(500mg/l)。

缓冲剂包括l-磷酸甘油二钠盐水合物(1.5g/l)以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1.2g/l)。

再者，白蛋白的浓度为：2g/l。

其他蛋白包括holotransferrin(人全铁转铁蛋白)，营养因子包括cholesterol(胆固醇)、egf以及bfgf。

这些添加物的浓度为：holotransferrin5mg/l、cholesterol0.125mg/l、egf0.001mg/l以及bfgf0.001mg/l。

根据上述制备间充质干细胞的无血清培养基，并用于间充质干细胞的原代、传代和扩增培养。本发明使用脐带来源间充质干细胞作为技术实施对象材料，按照以下步骤方案进行脐带间充质干细胞的分离、原代培养、传代和扩增培养。通过记录传代培养细胞的细胞形态、生长曲线和流式细胞分析细胞表面抗原，分析使用本发明提供的无血清培养基扩增间充质干细胞的效果(结果如图1、图2和图3所示)。

脐带间充质干细胞分离：

1)脐带组织取下后采用pbs充分冲洗多次以去除残留的血液，并剪成细小的组织碎块(1mm³)；

2)加入胰酶消化液后，37℃持续消化30min，800rpm，离心5min，弃上清；

3)重悬细胞，并移入含分离液的离心管，900rpm，离心5min，吸取白膜层；

4)pbs洗涤两次，900rpm，离心5min；

5)培养液重悬细胞，按每平方厘米1-2×10⁶个细胞接种于175cm²培养瓶，37℃，5％co2培养；

6)3天后首次细胞换液，用pbs冲洗2次以去除未贴壁生长的细胞；

7)之后每3-4天换液一次，当细胞生长到培养瓶80％-90％面积时，消化收获细胞；

8)弃培养液，pbs洗涤2次，加入消化液消化，显微镜下观察细胞消化状况(显微镜下可见间充质干细胞之间的间隙逐渐增大，细胞的胞质出现回缩最终呈圆形漂起，轻微摇晃培养瓶，细胞从培养瓶壁中脱落)，将脱落细胞移入离心管，900rpm，离心5min，弃上清；

9)沉淀为收获的间充质干细胞，为原代培养细胞。

脐带间充质干细胞的传代和扩增培养

1)培养液重悬原代培养间充质干细胞，按每平方厘米1-2×10⁶个细胞，接种于175cm²培养瓶，37℃，5％co2培养；

2)当细胞生长满培养瓶80％-90％面积时，消化收获细胞；

3)收获的间充质干细胞，按1:3比例进行细胞传代，37℃，5％co2培养。

4)当间充质干细胞生长满培养瓶80％-90％面积时，再次重复上述步骤，以进行细胞的扩增培养。

流式细胞仪检测脐带间充质干细胞

1)收获培养生长至80％的融合度时的细胞，消化收获细胞，pbs洗涤2遍；

2)加pbs重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml；

3)加入抗体，在室温下孵育30min；pbs洗涤1次，离心去除多余的抗体；

4)用500ulpbs重悬细胞，并转移至流式管中，上流式细胞仪检测并记录结果。流式细胞仪检测以下细胞免疫表型：表达阳性cd29、cd73、cd90和cd105；表达阴性cd14、cd34、cd45、cd79a、hla-dr。

分析结果

1)细胞形态观测

如图1所示、细胞保持良好的贴壁性，呈现出梭形的成纤维细胞形态，同时经多代培养后，细胞仍可保持正常状态。

2)细胞生长效率

分别在细胞培养0h、24h、48h、72h、96h对细胞进行计数，绘制生长曲线，如图2所示。

3)细胞免疫表型检测

如图3所示，cd29、cd73、cd90和cd105阳性表达物达95％以上；而cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr等阴性表达物检测显示在2％以下，达到临床应用水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。