miRNA-378及其抑制剂的应用和应用其的产品的制作方法

本发明涉及医学工程技术领域，尤其是涉及一种mirna-378及其抑制剂的应用和应用其的产品。

背景技术

血管平滑肌是指存在于血管壁且组成其主要部分的特定类型平滑肌，血管平滑肌的主要功能是通过收缩或松弛调节血管的管径。而血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，vsmc)是维持血管张力和功能的主要细胞成分，正常情况下，血管壁为分化成熟的vsmc，以收缩型(分化型)为主，增殖速度极慢，通过舒一缩功能维持血管壁的紧张性。当血管壁受损或vsmc受到生长因子的刺激时，vsmc会从分化型转化为去分化型(分泌型)，细胞进入分裂周期，获得增殖能力。vsmc转化为去分化型后，首先，从血管中膜迁移至血管内膜，然后，分裂增殖，并分泌大量的细胞外基质(extracellularmatrixc，ecm)，使血管内膜增厚，形成新生的血管内膜。

研究结果证实动脉粥样硬化、高血压或ptca术后再狭窄等许多心血管疾病中血管结构和功能的改变都与血管壁中血管平滑肌细胞的变化密切相关。由于vsmc是唯一通过增殖、迁移及合成细胞外基质等生物学功能来修复血管壁的损伤，大量研究证实，动脉内膜损伤后，如果vsmc异常增殖，会导致血管内膜异常增生，从而引起动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的发生。因而研究vsmc增殖的防治药物，对治疗动脉粥样硬化、血管内膜成形术后血管再狭窄等血管增殖性疾病十分必要。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供mirna-378在制备用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物中的应用，本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的试剂盒，本发明的第三个目的在于提供mirna-378的抑制剂在制备用于治疗和/或预防血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物中的应用，本发明的第四个目的在于提供一种用于治疗和/或预防血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物，以缓解现有技术中存在的对vsmc增殖的防治药物研究不足的技术问题。

本发明提供了mirna-378在制备用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物中的应用，所述mirna-378含有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病包括血管支架后再狭窄和/或动脉粥样硬化。

本发明还提供了一种用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测mirna-378的引物。

进一步地，所述用于特异性检测mirna-378的引物包括如seqidno.2所示序列的上游引物和如seqidno.3所示序列的下游引物。

本发明还提供了mirna-378的抑制剂在制备用于治疗和/或预防血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物中的应用，所述mirna-378含有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病包括血管支架后再狭窄和/或动脉粥样硬化。

另外，本发明还提供了一种用于治疗和/或预防血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物，所述药物包括mirna-378的抑制剂。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

进一步地，所述药物的给药方式包括口服给药或者注射给药；

优选地，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射、或者冠状动脉内注射。

进一步地，所述mirna-378的抑制剂具有如seqidno.4所示的核苷酸序列；

优选地，所述mirna-378抑制剂的核苷酸序列的每个碱基均进行了2’-o-甲基修饰。

本发明提供的mirna-378通过实验发现在血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病中明显高表达，通过对mirna-378进行特异性的检测能达到诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的目的。并且差异表达mirna-378之后，能够明显的改变vsmc细胞的增殖、迁移和浸润等生物学功能。而且，mirna-378的抑制剂通过抑制mirna-378的表达，能够明显改善诱导动脉粥样硬化发生的vsmc的表型转换。将mirna-378的抑制剂作为药物，导入血管或体内，对血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病将具有预防及治疗作用。因此，mirna-378可以作为一种新的生物标志物，应用血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的诊断；而与之相应的mirna-378的抑制剂，可以作为一种新型的药物用于血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的预防和/或治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的mirna-378在动脉粥样硬化模型小鼠中主动脉中表达情况的结果图；

图2为本发明实施例1提供的mirna-378在动脉粥样硬化临床样本中的表达情况的结果图；

图3a为本发明实施例2提供的采用mtt方法检测的ha-vsmc细胞增殖情况的结果图；

图3b为本发明实施例2提供的采用edu方法检测的ha-vsmc细胞增殖情况的结果图；

图4a为本发明实施例3提供的采用划痕法检测细胞的迁移能力的显微结果图；

图4b为本发明实施例3提供的采用划痕法检测细胞的迁移能力的折线结果图；

图5a为本发明实施例3提供的采用transwell法检测细胞的侵袭能力的显微结果图；

图5b为本发明实施例3提供的采用transwell法检测细胞的侵袭能力的统计结果图；

图6a为本发明实施例4提供的采用westernblot检测vsmc表型转换标记蛋白a-sma和smmhc2的表达的结果图；

图6b为本发明实施例4提供的采用imagej计算westernblot条带灰度值的结果图

图7为本发明实施例5提供的生物信息学分析mirna-378在不同物种中的下游靶标情况的结果图；

图8a为本发明实施例6提供的采用real-timepcr检测cdk1的表达的结果图；

图8b为本发明实施例6提供的采用westernblot检测cdk1的表达的结果图；

图8c为本发明实施例6提供的采用westernblot检测cdk1的表达的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了mirna-378在制备用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物中的应用，所述mirna-378含有如seqidno.1所示的核苷酸序列：

5’-cuccugacuccagguccugugu-3’(seqidno.1)。

其中，本发明中涉及的mirna-378可以为：与seqidno.1所示序列完全相同的序列，或者含有seqidno.1所示序列的序列，或者seqidno.1所示序列的生物活性功能片段，或者seqidno.1所示序列的变体。凡是具备seqidno.1所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与seqidno.1所示序列完全相同的序列。

在一些优选的实施方式中，所述血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病包括血管支架后再狭窄和/或动脉粥样硬化。

动脉粥样硬化是心血管疾病致残致死的主要原因，是最常见的和最具有危害性的疾病之一，严重影响人类健康，往往累及心、脑、肾等器官，严重影响了人们的生活质量和生命安全，所以诊断和治疗动脉粥样硬化具有重要意义。

冠状动脉疾病是目前世界上发病率和死亡率最高的疾病之一，冠状动脉血运重建(恢复心肌血流量)是阻塞性冠心病的标准治疗方式，支架植入已成为最常用的血运重建手段。然而其术后再狭窄一直是一个影响其远期疗效的重要问题，因此，对血管支架后再狭窄的诊断和治疗同样具有重要意义。

本发明还提供了一种用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测mirna-378的引物。

在一些优选的实施方式中，所述用于特异性检测mirna-378的引物包括：

mirna-378-f：

5’-ctcctgactccaggtcctgtgt-3’(seqidno.2)；

mirna-378-r：

5’-gtatcaacgcagagtacttt-3’(seqidno.3)。

需要说明的是，除seqidno.3所示的核苷酸序列，加尾法中mirna通用引物均可作为mirna-378-r使用。

在一些优选的实施方式中，用于诊断血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的试剂盒还包括特异性检测mirna-378的探针，所述探针具有如seqidno.5所示的核苷酸序列，同时进行s代修饰和2’-ome修饰：

dig-cuccugacuccagguccugugu-dig(seqidno.5)。

本发明还提供了mirna-378的抑制剂在制备用于治疗和/或预防血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物中的应用，所述mirna-378含有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

在一些优选的实施方式中，所述血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病包括血管支架后再狭窄和/或动脉粥样硬化。

另外，本发明还提供了一种用于治疗和/或预防血管平滑肌细胞异常增殖相关疾病的药物，所述药物包括mirna-378的抑制剂。

其中，mirna-378的抑制剂例如可以为，但不限于sirna-378、含有sirna-378的编码基因的重组载体、含有sirna-378的编码基因的重组病毒或含有sirna-378的编码基因的重组病毒载体。

在一些优选的实施方式中，所述药物中，mirna-378的抑制剂的有效剂量为10-200mg/kg，例如可以为，但不限于10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、80mg/kg、100mg/kg、120mg/kg、150mg/kg、180mg/kg或200mg/kg。

在一些优选的实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

其中，载剂例如可以为，但不限于壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。

在一些优选的实施方式中，所述药物的给药方式包括口服给药或者注射给药；

优选地，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射、或者冠状动脉内注射。

进一步地，所述mirna-378的抑制剂具有如seqidno.4所示的核苷酸序列：

5’-gaggacugagguccaggacaca-3’(seqidno.4)

优选地，所述mirna-378单链抑制剂(inhibitor)的核苷酸序列的每个碱基均进行了2’-o-甲基修饰，用以增加它的结构稳定性。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。

除非特别指出，以下实施例中涉及的mirna，即为mirna-378。

除非特别指出，以下实施例中涉及的mirna-378的核苷酸序列即为seqidno.1所示的序列。

材料

以下各实施例中使用的主要实验材料和试剂如下：

ha-vsmc细胞购自atcc(美国标准生物品收藏中心)；

trizol试剂购自sigma有限公司；

dntps购自takara公司；

m-mlv逆转录酶购自takara公司；

核糖核酸酶抑制因子(ribonucleaseinhibitor)和real-timertpcr试剂盒均购自takara公司；

a-sma，sm-mhc2，cdk1，p21，β-actin等抗体购自abcam公司；

引物序列委托华大公司合成。

如无特殊说明，本发明实施例中：

mirna-378抑制剂序列为：5’-gaggacugagguccaggacaca-3’(seqidno.4)；

mirna-378模拟剂序列为：5’-cuccugacuccagguccugugu-3’(seqidno.1)；

阴性对照nc的序列为：5’-caguacuuuuguguaguacatt-3’(seqidno:6)。

实施例1mirna-378在小鼠动脉粥样硬化主动脉组织和临床血液样本中表达量的测定

本实施例选取高脂饲养3个月的apoe^-/-小鼠(c57bl/6j)摘取的主动脉和临床血液样本。之后，triquick试剂提取总rna，制备c-dna，real-timertpcr法检测mirna-378的表达量，并且以健康小鼠主动脉和健康人的血液作为对照。

1、总rna提取：

采用triquick试剂分别提取细胞总rna。

(1)选取0.1g主动脉组织或者300μl血清直接加入1mltriquick。用取样器吹打混匀。

(2)4℃12000rpm离心10min，取上清。每使用1mltriquick向样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。

(3)4℃12000rpm离心15min，样品分为三层。rna主要在无色的水相。把水相转移到新管中。

(4)在转移到新管中的水相中加入等体积的冰冷异丙醇，混匀，室温放置20min。

(5)4℃12000rpm离心10min，去上清。加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)洗涤沉淀。4℃7000rpm离心5min，弃上清。

(6)室温放置凉干，加入适量rnase-free水，充分溶解rna。

(7)-80℃保存rna样品。

2、mirna-378的c-dna制备

加m-mlv前后充分混匀，42℃1h，95℃5min，-20℃保存样品。

3、real-timepcr法检测lncrna-punisher的表达量

采用real-timertpcr试剂盒(购自takara公司)检测mirna-378的表达量。

1)设计引物序列如下：

mirna-378-f：

5’-ctcctgactccaggtcctgtgt-3’；

mirna-378-r：

5’-gtatcaacgcagagtacttt-3’。

2)mirna-378rreal-timertpcr反应体系如下：

real-timertpcr反应条件如下：

3)数据处理：

mirna-378表达量用下式计算：

δct样品＝ct样品-ct样品u6

δct对照＝ct对照-ct对照u6

δδct＝δct样品-δct对照

mirna-378相对表达量变化＝2-δδct。

结果如图1和图2所示，从图1中可以看出，与健康组小鼠对比，表达量明显增多；从图2中可以看出与健康人对比，表达量明显上调。

实施例2mirna-378抑制剂降低ha-vsmc细胞的增殖和迁移

血管平滑肌细胞是血管壁的主要组成成分之一。血管平滑肌细胞的过度增殖、迁移和浸润对于动脉粥样硬化的发生、发展有着重要影响。在生理状态下，vsmc以比较慢的速度进行更新，而在动脉粥样硬化发展时期，vsmc增殖、迁移和浸润加速，从而造成了动脉内膜粥样的突起和斑块的产生。

本实施例中，mirna转染处理是通过脂质体lipfectin2000进行，转染操作按照试剂盒操作说明书进行，脂质体lipfectin2000购自invitrogen公司；

本实施例中的edu溶液购自广州锐博；

本实施例中的细胞固定液为即含4％多聚甲醛的pbs缓冲液；

本实施例中的渗透剂为含0.5％tritonx-100的pbs缓冲液；

使用人血管平滑肌细胞ha-vsmc为细胞模型。

对细胞(细胞量约为1×10⁶)进行mirna模拟剂和抑制剂转染处理，转染4小时后换正常培养基，继续培养1-2天，于培养箱中孵育不同时间后弃去100μl培养基，加入10μlmtt(终浓度500μg/ml)，继续培养4小时后加入150μldmso溶解形成的甲瓒颗粒，用酶标仪检测od490nm光吸收值。

实验结果如图3a所示，图3a示出了采用mtt方法检测的ha-vsmc细胞增殖情况，图中结果表明提高内源性mirna-378可以显著促进细胞的增殖能力。

在本实施例中，同时采用了edu染色法检测mirna-378的促进ha-vsmc细胞增殖的影响。对细胞(细胞量约为1×10⁶)进行mirna-378的模拟剂转染处理，转染4小时后换正常培养基，继续20小时。用细胞培养基按1000:1的比例稀释edu溶液，制备适量50μmedu培养基，每孔加入100μl的50μmedu培养基孵育2小时，弃培养基；pbs清洗细胞1-2次，每次5分钟；每孔加入100μl细胞固定液室温孵育30分钟；弃固定液，pbs清洗细胞1-2次，每次5分钟；每孔加入2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μlpbs，脱色摇床清洗5分钟，弃pbs；每孔加入100μl渗透剂脱色摇床孵育10分钟；pbs清洗1次，5分钟；用去离子水按100：1的比例稀释试剂f，制备适量1×hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μl1×hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μlpbs清洗1-3次；每孔加入100μlpbs保存待用，最后进行图像获取及分析，调试仪器时，将曝光时间调整为30毫秒左右，尽量不要大于1秒。

实验结果如图3b所示，图3b示出了采用edu方法检测的ha-vsmc细胞增殖情况，图中结果表明提高内源性mirna-378可以显著促进细胞的增殖能力。

在本实施例中，采用划痕法检测细胞的迁移能力，具体操作如下：

将细胞密度为5×10⁵个/ml的c6细胞铺于24孔板(每孔500μl)上，进行mirna-378的模拟剂转染处理，转染4小时后换正常培养基，继续20小时。加入含10％胎牛血清的dmem培养液，培养16h，使形成单层细胞。用10μl移液枪枪头(或者无菌牙签)在单层细胞上呈“一”字划痕，用pbs清洗3次，加入无血清培养基，放入37度5％co2培养箱培养。按0，12，24，36，48小时取样，拍照。

实验结果如图4a和图4b所示，图中结果表明提高内源性mirna-378可以显著促进细胞的迁移能力。

在本实施例中，采用transwell法检测细胞的侵袭能力，具体操作如下：

用50mg/lmatrigel1:10稀释液包被transwell小室底部膜的上室面，37℃温育；将mirna-378的抑制剂和模拟剂转染处理后12小时细胞消化，用pbs和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×10⁵/ml；在transwell下室(即24孔板底部)加入600-800μl含10％血清的培养基，上室加入100-150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；用镊子小心取出上室，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟；取出上室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl结晶紫染液的孔中，室温染色15-30分钟；轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出上室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；每孔每次加入100μlpbs清洗1-3次；显微镜下取5个随机视野计数，统计结果。

实验结果如图5a和图5b所示，图上示出了改变内源性的mirna-378能够显著调控ha-vsmc细胞的迁移能力影响。

实施例4mirna-378促进了血管平滑肌细胞有收缩性向合成型转换

vsmc分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)两种表型。收缩表型是其中的成熟类型，分化程度高，正常成人动脉血管内的vsmc以收缩型为主，主要功能是维持血管的弹性和收缩血管，增殖、迁移能力差或无增殖、迁移能力，细胞呈梭形或条带状，含有丰富的肌丝，结构蛋白含量多，合成基质能力无或差。合成表型属于不成熟类型，分化程度低或未分化，形态上类似成纤维细胞，呈扁平形，肌丝含量少，结构蛋白少，合成和分泌基质蛋白能力强，主要功能是增殖、迁移入内膜形成病理改变和合成基质，细胞体积比收缩型为大，主要位于胚胎中期血管或病理血管(如ptca后再狭窄等病变血管)中。在血管病变部位，表型发生转化的vsmc在增殖的同时合成与分泌各种细胞因子和细胞外基质，在as斑块形成和rs发生过程中发挥重要的作用。

在本实施例中，采用westernblot法检测细胞的表型转换标记蛋白，具体操作如下：

c6细胞(5×10⁶细胞/ml)进行mirna-378的抑制剂和模拟剂转染处理，转染4小时后换正常培养24小时候收集细胞。用冷pbs洗三次，加入300μl裂解缓冲液裂解20分钟(20mmtris-hcl，ph7.4；2mmedta，2mmegta，50mmb-glycerophosphate，1mmsodiumorthovanadate，1mmdithiothreitol，1％tritonx-100，10％glycerol，10mg/ml10μg/mlaprotinin，10μg/mlpepstatin，1mmbenzimideand2mmhydrogenperoxide)。在4℃下离心10分钟，收集上清蛋白，储存在负20℃，直到使用。细胞裂解物用免疫印迹法进行分析。蛋白质是10％sds聚丙烯酰胺凝胶的分离，pvdf转膜后，在室温下，用tris缓冲盐水孕育60分钟(3％bsa，20mmnaf，2mmedtaand0.2％tween20)。特异性一级抗体(a-sma，smmhc2，b-actin)在4度将膜孵育60分钟，使用相同缓冲液洗涤3次，每次10分钟。辣根过氧化物酶二抗在4度将膜孵育60分钟，缓冲液洗涤3次。ecl系统检测。

结果如图6a和图6b所示，图6a是wb结果，6b是利用imagej计算wb条带灰度值的结果。从结果图中可以看出，在ha-vsmc细胞中，抑制内源性mirna-378能够显著抑制vsmc表型转换标记蛋白a-sma和smmhc2的表达

实施例5生物信息学方法预测mirna-378的下游靶标是周期调控蛋白cdk1

图7为根据生物信息学预测网站(http://www.targetscan.org)的预测信息，mirna-378与cdk1的3‘utr区能够在存在结合位点；并且这种结合在不同物种(人、大鼠、狗、猩猩等)中的都存在，非常保守，是潜在的重要结合位点。

实施例6mirna-378能够显著调控下游靶标cdk1的表达

在本实施例中，采用real-timepcr法和westernblot法检测cdk1的表达情况，具体操作如下：

c6细胞(5×10⁶细胞/ml)进行mirna-378的抑制剂和模拟剂转染处理，转染4小时后换正常培养24小时候收集细胞rna和蛋白(如实施例1和4)，分别采用real-timepcr和westernblot进行检测(如实施例1和4)。

结果如图8a、图8b和图8c所示，图8a是real-timepcr结果，图8b和8c是利用westernblot的结果；从结果图中可以看出，在ha-vsmc细胞中，提高内源性mirna-378能够显著抑制下游cdk1的表达。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>青岛大学

<120>mirna-378及其抑制剂的应用和应用其的产品

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

cuccugacuccagguccugugu22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctcctgactccaggtcctgtgt22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtatcaacgcagagtacttt20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gaggacugagguccaggacaca22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cuccugacuccagguccugugu22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

caguacuuuuguguaguacatt22