本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及一种影响猪红细胞数目的snp分子标记，尤其与80日龄猪红细胞数性状snp分子标记相关。本发明的分子标记可用于猪红细胞数目(rbc)性状的预测。
背景技术
近年来随着我国畜牧业的迅速发展，在育种实践中人们单纯追求高产性能导致畜禽的抵抗力不断降低，集约化养殖程度的提高和饲养条件的改变又引起了许多新传染病的发生和流行(严燕，2007)。据统计，发展中国家畜牧业每年因疾病造成的经济损失超30％，局部地区甚至高达50％，而发达国家通常的17％(王超，2014)。猪病的频发已成为我国生猪业面临的重大问题，严重制约了养猪业的发展，不仅造成巨大的经济损失，而且还带来了其他问题，如环保问题，抗生素残留问题，食品安全问题等。可见做好疾病防控是生猪业发展的前提条件。在猪生产中，疾病尤其是病毒性传染病严重威胁着猪的健康，即使预防接种和药物治疗发挥了重要作用，但其并不能完全控制和消灭传染病的发生与流行，而且药物和疫苗的大量使用使得病原微生物变异加快，疫病控制更加困难(孙寿永，2005)。在这种背景下，借助于现代分子遗传育种的理论和手段从遗传本质上提高动物对病原的抗性,加强免疫功能,开展抗病育种具有治本的功效(袁峥嵘，2007)。抗病育种巨大的潜在经济效益以及某些畜病作为研究人类疾病动物模型的诱人前景,使动物抗病育种逐步成为动物育种家们关注的焦点。
决定动物抗病性强弱最重要的因素便是免疫系统，免疫系统决定了动物抵抗细菌、病毒的能力(阳建辉，2011)。在对免疫系统的研究中一般会选用和病原微生物作用机理相似的免疫刺激剂。polyi:c是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物，是一种人工合成的dsrna，作为天然dsrna的拟似物，能够模拟病毒感染后所形成的dsrna，刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应，免疫学研究中常用其作为免疫刺激剂，来模拟rna病毒感染的致病机制，为提高机体免疫机能寻找有效方法(王继英等，2015)。
血红细胞源于骨髓多能干细胞,在全血中容积百分比约50％,是血液的最主要的细胞成分。过去一直认为,红细胞结构简单,其功能亦单一,仅是运输o2和co2的工具。随着免疫学的深入发展,人们开始对红细胞有了全新的认识。从20世纪50年代到70年代,人们首次发现红细胞具有免疫黏附功能,而且发现黏附的复合物更易被白细胞吞噬，更有人证实了人类红细胞所具有的免疫黏附功能是通过补体c3b受体实现的，且红细胞上分离纯化了i型补体c3受体(cr1),其总数的95％以上都在红细胞膜上(甘慧等，2005)。现已证实,红细胞具有黏附、杀伤抗原,清除免疫复合物,参与机体免疫调控的作用,而且其自身存在完整的自我调控系统,是完整机体免疫系统中的重要组成部分(崔恒敏等，2003)。免疫物质是免疫细胞行使免疫功能的物质基础,红细胞的免疫相关物质包括:补体受体cr1、cr3、淋巴细胞功能相关抗原cd44、人类补体膜辅助因子蛋白(mcp)、降解加速因子(daf)、过氧化物酶、过氧化物歧化酶(sod)、阿片肽受体、nk细胞激活因子(nkef)以及红细胞趋化因子受体等(denommega等，2004)。而红细胞的免疫功能是红细胞膜上补体受体具有免疫粘附、携带及清除循环液相中抗原异物的功能,尤其是清除cic为红细胞最主要的免疫功能，不仅如此，它还具有识别呈递抗原，杀死细胞样，以及对吞噬细胞及淋巴细胞起调控作用的功能(郭峰等，2002)。并且，动物机体红细胞数目远远大于白细胞数，毫无疑问，猪rbc的正常与否与其抗病能力具有紧密的联系。随着临床兽医学的快速发展，许多检测技术得到推广应用，血常规检测具有重复性好、方便快捷、高效等特点，可以通过红细胞数来判断猪的健康程度。所以筛选出与猪rbc显著相关的分子标记及基因对抗病育种具有重要意义。
本发明中发现的snp与猪rbc性状的相关性达到了显著水平，为家猪免疫及生长性状的研究提供了新的遗传资源。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，完善家猪抗病育种分子标记资源的发掘，利用基因芯片技术对snp进行分型，并使用全基因组关联分析(gwas)筛选与注射聚肌胞后对猪细胞数目(rbc)性状相关的snp，该片段与80日龄猪红细胞数性状相关。本发明为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源。
本发明的技术方案如下所述：
申请人通过基因分型技术并参阅ensembl，得到登录号为marc0065518基因上下游100bp的核苷酸片段(seqidno:1所示的序列)。该片段与80日龄猪红细胞数性状相关。具体序列如下所示：
agggaaagtagattcattaattaatctttaaaaacgccttccagatgatgctggtacacagaaactttgagaatcactgtcccaggcctgccctctcctgr(t/c)tgcgggcatcctagtgggtggatgggcaaaggagcagcctcctaaaagtctggactcagaaatgtcacatattgataatttcctccacattttattgtct，
上述序列的第101位碱基处的r为t或c(即，seqidno:1所示的序列的101位碱基是突变后的碱基c),该突变使上述序列，即seqidno：1所示的序列产生了多态性。
该序列可以作为检测与猪免疫性状相关的分子标记；且当seqidno：1上的第101位核苷酸为c时，表示猪具有更高的红细胞数目。
上述序列可以作为检测与猪免疫性状相关的(例如检测与80日龄猪红细胞数性状相关)分子标记应用。
申请人提供了一种筛选猪红细胞数目性状相关snp分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：
①提取猪耳朵基因组dna，并对dna进行质量检测；
②利用基因芯片技术进行分型；
③采用基于固定模型和随机模型的方法，利用r统计环境下的mvp软件包进行全基因组关联分析(gwas)。具体的回归模型如下：(1)固定模型yi＝mi1b1+mi2b2+…+mitbt+sijdj+ei，其中yi是对第i个个体的观察值；mi1，mi2，...，mit分别是t个假设qtn的基因型；b1，b2，...，bt分别是t个遗传标记的效应值；ei是残差误差，服从正态分布，ei～n(ue,σ2e)，σ2e表示残差方差。(2)随机模型yi＝ui+ei，其中yi是对第i个个体的观察值；ei是残差误差，服从正态分布，ei～n(ue,σ2e)，σ2e表示残差方差；ui是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行了主成分分析，将前三个主成分作为协变量加入模型中。
与现有技术相比本发明具有的有益效果：
本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前目前常用的pcr-rflp、elisa、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表seqidno：1是本发明克隆的登录号为marc0065518基因上下游100bp核苷酸片段。该片段即是本发明筛选的分子标记。序列长度为为201bp，在该序列的101位碱基处的r存在一个t/c等位基因突变。
图1：本发明的总体技术流程示意图。
图2：是本发明克隆的登录号为marc0065518基因上下游100bp核苷酸序列，即本发明筛选的分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图2显示核苷酸序列的第101位碱基处存在一个t/c等位基因突变(101bp处的英文字母“r”为突变位点)。
图3：是本发明的曼哈顿图。附图标记说明：黑色圆圈标记并由红色箭头指向的点为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第8号染色体上。
具体实施方式
实施例1：基因分型检测
(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸f2代群体的耳朵组织基因组dna
1)将杜洛克×二花脸f2代猪群体(由广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×set(1ml)，蛋白酶k(10ng/ml)至终浓度200ug/ml，再加入10％浓度的十二烷基硫酸钠(sds)至终浓度为0.5％，摇匀，在55℃水浴中温育过夜消化。
2)将消化后的组织样加入等体积的tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中，在4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标记相应记号。
3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)离心机中，在11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。
4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)冷冻离心机中，在11000rpm离心10min。
5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状dna。
6)用枪头将dna沉淀挑出，置于装有对应号码的ep管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解dna。
7)在dna浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电压的电泳仪中电泳约2h，在紫外灯下检测提取的dna质量。
(2)snp基因型的判定
使用illumina公司研制porcinesnp60beadchip全基因组芯片，该芯片包含超过60000个snp位点，以步长平均每40kb有一个标记，覆盖猪的基因组。此芯片整合了多种猪的基因差异，包括杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，能提供足够的snp密度，可应用于全基因组关联分析中。
(3)质量控制
用plinkv1.9软件(来自shaunpurcell公司)对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率为<90％，次等位基因频率(minorallelefrequency,maf)为<0.03，偏离哈代温伯格(hardy-weinbergequilibrium,hwe)p≤10-6的snp标记和检出率为<90％的个体，最终有197个个体和43111个snp用于gwas研究。
实施例2：本发明的分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用
(1)marc0065518分子标记分型结果与免疫性状关联分析
用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司培育的杜洛克×二花脸杂交的f2代群体(均为常规品种)。基因分型所用的dna由杜洛克×二花脸杂交的f2代(说明书正文和表中所称的“杜洛克×二花脸杂交的f2代”简称“猪”)耳样提取，用于血常规检测和流式分析的血液采自80日龄的猪，其在接种聚肌胞(polyi:c)4小时后采集血样。采用基于固定模型和随机模型的方法，未将性别作为固定效应，在利用r统计环境下的mvp软件包进行gwas分析。(1)固定模型yi＝mi1b1+mi2b2+…+mitbt+sijdj+ei，其中yi是对第i个个体的观察值；mi1，mi2，...，mit分别是t个假设qtn的基因型；b1，b2，...，bt分别是t个遗传标记的效应值；ei是残差误差，服从正态分布，ei～n(ue,σ2e)，σ2e表示残差方差。(2)随机模型yi＝ui+ei，其中yi是对第i个个体的观察值；ei是残差误差，服从正态分布，ei～n(ue,σ2e)，σ2e表示残差方差；ui是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行了主成分分析，将前三个主成分作为协变量加入模型中。关联分析结果见表1。
表1marc0065518多态性不同基因型对80日龄猪红细胞数的影响
表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。
由表1可知，基因型为cc的个体极显著高于基因型为tc个体，tc个体的红细胞数目极显著高于tt个体，cc个体的红细胞数目极显著高于tt个体所以c是有利于红细胞数增加的等位基因。
主要参考文献：
[1]严燕等，猪遗传抗性与抗病育种研究进展[j].猪业科学，2007(06):58-61；
[2]王超等,猪抗病育种的相关问题及研究进展[j].中国畜牧杂志,2014，50(22):67-72；
[3]孙寿永等，猪的抗病性及抗病育种[j].动物科学与动物医学,2005，22(12):60-61；
[4]袁峥嵘，动物抗病育种研究进展[j].畜牧与兽医，2007(09):68-70；
[5]阳建辉等，浅析规模化养猪场疾病发生原因与防疫对策[j].湖南农业科学,2011(1):130-133；
[6]王继英等，聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响[j].中国农业科学，2015，48(03):583-593；
[7]甘慧等，红细胞免疫研究的历史、现状和前景[j].国外医学(免疫学分册)，2005(04):227-230；
[8]崔恒敏等，动物红细胞免疫功能的研究进展[j].中国兽医科技，2003(05):23-27；
[9]denommega.thestructureandfunctionofthemoleculethatcarryhumanredbloodcellandplateletantigens[j].transfusmedrev,2004,18(3):203-231；
[10]郭峰，红细胞免疫的研究和意义[j].自然杂志,2002，24(5):268-273。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种影响猪红细胞数目的snp分子标记
<141>2018-08-31
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>201
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(201)
<220>
<221>mutation
<222>(101)..(101)
<400>1
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