一种半滑舌鳎性别差异指示标签microRNA的应用的制作方法

本发明属于鱼类生物技术领域，特别是海水鱼精液外泌体标志物应用领域。

背景技术

半滑舌鳎(cynoglossussemilaevis)是我国海域特有的近海底栖鱼类，同时因其味道鲜美、营养丰富也是重要的名贵海水养殖鱼类。

半滑舌鳎作为比目鱼，雌、雄鱼生长速度差异巨大，雌性的生长速度是雄性的2-4倍。半滑舌鳎雄鱼生长慢、个体小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，半滑舌鳎养成中雄性比例甚至可以达到80％—90％。研究发现在80％—90％比例的雄鱼中，有相当一部分是伪雄鱼。半滑舌鳎正常雄鱼具有zz型的染色体，正常雌鱼具有zw型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，但从它生理上表现的是雄性特征。也就是伪雄鱼的染色体和雌鱼一样，都是zw型，而它的体貌特征和生殖器官都和雄鱼一样，也可以像雄鱼一样产生可以受精的精子且繁育后代。而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父亲的特征成为伪雄鱼，通过这种逐代积累，就导致了半滑舌鳎雌雄比例的失衡。雄鱼越来越多，雌鱼越来越少。那么雄鱼和伪雄鱼除了基因和染色体水平有差别外，还有没有其他差别？本发明针对这个问题，开发了针对半滑舌鳎精液来源的外泌体提取及识别应用的方法，用以解决半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼生殖遗传差异的区分问题。

外泌体直径为30-120nm，是细胞外泌囊泡中体积较小的一种，广泛存在于动物体液内，包含不同的生物分子，如脂质，蛋白质和核酸。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。目前已经研究证实外泌体中存在多种18-23bp的小分子micrornas，其在进化上高度保守，性质稳定，易于定量检测，且存在生理、病理及来源特异性，具有生物标志物的特性，在生物分子标记应用中具有重要的价值。

然而，在海洋动物中外泌体来源的micrornas作为生物标志物的研究相对较少，本发明开发了针对以半滑舌鳎为代表的海水鱼精液来源的外泌体提取及初步应用的方法，解决了半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼精液外泌体的生物标记物差异识别的问题，具有创新性。

技术实现要素：

本发明的目的是针对半滑舌鳎雄鱼及伪雄鱼识别问题，提出一种半滑舌鳎精液来源的外泌体micrornas作为生物标记物识别雄鱼及伪雄鱼的方法。

本发明是采取以下技术方案实现的：

半滑舌鳎精浆外泌体microrna在性别鉴定中的应用，microrna性别标签为dre-mir-141-3p，其序列为taacactgtctggtaacgatgc。

本发明还提供一种所述microrna性别标签的筛选方法如下：

1)精浆外泌体分离鉴定后，对精浆外泌体smallrna进行测序分析，将cleanreads依次和rfam数据库、cdna序列、物种重复序列库、mirbase数据库对测序结果中的smallrna进行分类注释；将分类注释后的序列和mirbase数据库比对，进行已知microrna的统计；使用未注释上的序列进行新的microrna预测，microrna差异表达分析，差异表达mirna靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microrna作为候选micrornas生物标记物；

2)将候选标签micrornas按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的micrornas；(3)两样品中至少有一个的tpm值大于10；(4)foldchange值大于4，所述foldchange值＝tpmsample_zz./tpmsample_zw；最终得到23个候选microrna。

3)提取两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总rna，利用microrna定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的micrornas的差异表达情况，筛选出最具标签指示作用的mirnas作为最终的标签micrornas；根据统计学分析原理，p值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre-mir-141-3p，序列为taacactgtctggtaacgatgc，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。依据microrna定量分析结果，进行雄鱼和伪雄鱼的判定。

本发明还提供了一种半滑舌鳎性别鉴定试剂盒，所述试剂盒包括dre-mir-141-3p定量检测引物，所述引物序列为f：ggccgtaacactgtctggt；r：tcgtatccagtgcagggtc；逆转录引物dre-mir-141-3p-rt：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgagcatcgtt；内参基因为u6，以及其它逆转录试剂和pcr荧光定量试剂。u6的引物为：u6-f：ctcgcttcggcagcacatatact；u6-r：acgcttcacgaatttgcgtgtc。

进一步，引物探针序列的5’端标记了荧光基团，3’端标记淬灭基团，以适合taqmanprobe-basedqrt-pcr方法检测。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明运用精液外泌体micrornas进行半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼的判定，准确率达90％以上，且鉴定结果可靠，不会对鱼体造成创伤。

本发明同时利用该鉴别标签开发了检测的试剂盒，设计了针对该标签的扩增引物，方便快捷，简单高效。

附图说明

图1是本发明测序后经筛选的备选microrna及基于log2fg值的测序计算相对表达量；

图2是本发明提出的标志microrna经20个验证样本验证后的qrt-pcr表达量

图3本发明20个验证样本验证后在两组样本的qrt-pcr表达量均值

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

一种半滑舌鳎精浆外泌体mirnas作为生物标记物的筛选确定

1、精液样本的收集

收集半滑舌鳎性成熟雄鱼精液0.5ml于离心管中用于外泌体分离鉴定。

2、外泌体的提取

(1)精液样本取0.5ml转移1.5mlep管，放置于4℃，1200g离心15min去除精子细胞，4℃，15000g离心20min去除小细胞杂质和碎片，用pbs稀释1倍后，使用0.45um滤膜进行预过滤，过滤液再经0.22um滤膜过滤。

(2)样品用totalexosomeisolationkit试剂盒提取外泌体。

(3)离心后去上清，收集溶解样并完全转移至一个无rna酶的2ml管中。

3、外泌体的鉴定：日立h600iv型透射电镜观察，透射电镜分析鉴定后，剩余样品用于rna提取和测序分析。

4、外泌体的microrna测序分析

trizol法提取外泌体的rna，质检后构建小rna文库并基于illumina平台测序，完成测序后进行数据过滤分析，将cleanreads依次和rfam数据库、cdna序列、物种重复序列库、mirbase数据库进行比对注释。将注释后的序列和mirbase数据库比对，进行已知microrna的统计。使用未注释上的序列进行新的microrna预测，microrna差异表达分析，差异表达mirna靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与雄鱼、伪雄鱼两个样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对雄鱼、伪雄鱼两种样品具有指示作用的mirna作为候选标签micrornas。

5、将候选标签micrornas按照以下四个标准进行过滤：(1)在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；(2)与已知数据库进行比对确认存在的micrornas；(3)两样品中至少有一个的tpm值大于10；(4)foldchange值大于4，所述foldchange值＝tpmsample_zz./tpmsample_zw；见图1。

6、提取随机两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总rna，利用microrna定量分析试剂盒定量检测步骤5)过滤后的micrornas差异表达情况，选取2^-δδct进行计算分析，筛选出最具标签指示作用的micrornas作为最终的标签micrornas；根据统计学分析原理，p值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre-mir-141-3p，序列为taacactgtctggtaacgatgc，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。

实施例2

随机利用半滑舌鳎精浆外泌体microrna标志物鉴定雄鱼和伪雄鱼

基于精液外泌体microrna标志物dre-mir-141-3p的鉴定试剂盒包括dre-mir-141-3p的检测引物；所述引物序列为f：ggccgtaacactgtctggt；r：tcgtatccagtgcagggtc，引物包含逆转引物dre-mir-141-3p-rt：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgagcatcgtt；内参基因为u6，u6的引物为：u6-f：ctcgcttcggcagcacatatact；u6-r：acgcttcacgaatttgcgtgtc，此外试剂盒包含定量pcr反映的其它常规试剂：逆转录酶，taq酶，dntp，缓冲液，mgcl2，depc水及对照品。引物探针序列的5’端标记了荧光基团，3’端标记淬灭基团，以适合taqmanprobe-basedqrt-pcr方法检测。

该试剂盒应用的反应体系为10ul体系，即0.5ul10*microrna引物探针、5ul2*mastermix、2.5ulddh2o、2ulcdna模版。使用thermofisher的q6实时荧光定量pcr检测，反应的程序为：95℃2min；95℃10s,59℃60s,循环40次。样品检测设3个平行。利用特异引物检测经染色体确认的10尾半滑舌鳎伪雄鱼和10尾半滑舌鳎雄鱼的标签microrna，即dre-mir-141-3p的表达情况，结果如表1、图2、图3所示。该标签在两组样本中的表达差异极为显著(p＜0.01)，验证标签mcroirna的检测准确率达90％以上。

对于本领域的技术人员，对本发明针对的构思及技术要点进行变形，相应的改变应属于本发明所请求的权利要求。

表120个验证样本qrt-pcr表达数据

序列表

<110>天津渤海水产研究所

<120>一种半滑舌鳎性别差异指示标签microrna的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctcgcttcggcagcacatatact23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acgcttcacgaatttgcgtgtc22

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>半滑舌鳎(cynoglossussemilaevisgunther)

<400>3

taacactgtctggtaacgatgc22

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggccgtaacactgtctggt19

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tcgtatccagtgcagggtc19

<210>6

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgagcatcgtt51