一种mRNA3’末端混合建库的反转录引物及其用途的制作方法

本发明涉及一种mrna3’末端混合建库的反转录引物及其用途。

背景技术

随着新一代高通量测序技术的快速发展，转录组测序(rna-seq)已经成为研究转录组与基因表达的重要手段。然而，常规转录组研究技术主要存在以下问题：基因表达定量不准确、建库和测序价格高。

为了解决上述问题，目前已经开发了mrna3’末端测序技术，该技术提高了基因表达定量的敏感性和准确性。目前lexogen公司的mrna3’末端建库试剂盒最多能混合96个样本(lexogen，https：//www.lexogen.com/quantseq-3mrna-sequencing/#quantseqworkflow)，可以进行96个样本的自动化建库，该试剂盒省去了mrna分离的复杂操作，前期操作简单成本低，但后期96个样本需要平行独立进行建库操作，而且该产品只有96个双端index，上机时每条lane最多只能混合96个样本，不适合目前novoseq测序仪一条lane需要混合大量样本产出800g以上数据的需求，不适合大规模群体文库构建。

为了进一步提高混合建库的通量和降低文库构建成本，2017年，bush等(plate-seqforgenome-wideregulatorynetworkanalysisofhigh-throughputscreens，bush，e.cetal.，naturecommunications，8，doi：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)建立了转录组表达合并文库扩增(plate-seq)技术，该技术使建库工作量大大降低，可在一定程度上降低建库成本，然而，plate-seq文库进行测序时，测序读段(reads)r1端样本标签barcode序列以后的碱基质量很差，基本无法用于后续的数据分析。为避免数据浪费，bush等只将测序读段(reads)r1端测了26bp以读取barcode序列区分样本，后续分析全部使用测序读段(reads)r2端序列。因此，该方法构建的文库只能使用定制化的测序流程进行测序，如果采用目前反应次数固定的测序试剂盒，进行标准的双端150/100bp测序，测序读段(reads)r1端除barcode以外的碱基基本不能用于后续分析。

此外，本领域已知，lexogen的mrna3’末端测序试剂盒市场价格约为260元/样本，plate-seq建库成本约为200元/样本，与常规转录组文库构建价格相比，尽管这两种建库方法的建库成本已经显著降低，但对于大量群体样本的高通量文库构建来讲，这两种建库方法的成本仍然偏高。

因此，对于基因表达定量准确并且建库成本低通量高的建库技术，目前在本领域中还存在着需求。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种mrna3’末端混合建库的反转录引物以及混合建库的方法。

根据本发明的一个目的，提供了一种mrna3’末端混合建库的反转录引物，所述反转录引物包含vn碱基。

在一个实施方式中，所述反转录引物为96个mrna的反转录引物。

在一个实施方式中，所述反转录引物选自表1所示的反转录引物：

表1

。

根据本发明的另一个目的，提供了一种mrna3’末端混合建库的方法，所述方法包括使用本发明的反转录引物对总rna进行反转录。

在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mrna，得到反转录的产物。

在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成。

在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：进行文库片段大小选择，以回收长度150-600bp的片段。

在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：进行pcr扩增，以富集模板dna。

在一个实施方式中，混合建库的方法还可包括以下步骤：用等体积的beckmanagencourtampurexpbeads纯化pcr产物，获得mrna3’末端混合文库。

根据本发明的另一个目的，提供了一种mrna3’末端混合建库的方法，所述方法包括以下步骤：

使用权利要求1至3中的任一项所述的反转录引物对总rna进行反转录；

将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mrna，得到反转录的产物；

对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成；

进行文库片段大小选择，以回收150-600bp的片段；

进行pcr扩增，以富集模板dna；

用等体积的beckmanagencourtampurexpbeads纯化pcr产物，获得mrna3’末端混合建库。

根据本发明的另一个目的，提供了一种使用本发明的反转录引物进行mrna3’末端混合建库的用途。

在一个实施方式中，所述的混合建库是mrna3’末端混合建库。

使用本发明的反转录引物能够带来以下有益的技术效果：

1)本发明以总rna为起始直接进行反转录，省去了plate-seq建库技术的mrna分离的复杂操作流程，降低了建库成本；

2)反转录时加入锚定碱基，保证从poly(a)的起始位点进行反转录，降低了测序读段(reads)中poly(a)碱基被连续测序的比例，显著提高了测序数据的质量；

3)操作简单，成本显著降低，成本降低至常规转录组的10％以下，建库成本约50元/样本；

4)配套测序平台novoseq、匹配相应的软件开发，建立了自动化、标准化、均一化、简便化的技术体系，使该项技术能够大规模广泛应用在各种动物和植物中，以满足高通量自动化群体转录组文库构建的要求。

附图说明

图1为总rna琼脂糖凝胶电泳图，其中marker是指全式金trans15kdnamarker(货号：bm161-01)，总rna为提取的植物总rna(例如，从玉米叶片中提取的总rna)。

图2为使用agilent2100检测的本发明建库片段长度分布图。

图3为使用agilent2100检测的对比实施例1建库片段长度分布图，其中对比实施例1与本发明的区别仅在于其反转录引物未加入锚定碱基(即vn碱基)，而本发明的反转录引物加入锚定碱基(即vn碱基)。

图4为使用agilent2100检测的对比实施例2(参照plate-seq文献方法，即plate-seqforgenome-wideregulatorynetworkanalysisofhigh-throughputscreens，bush，e.cetal.，naturecommunications，8，doi：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)建库片段长度分布图。

图5为本发明和对比实施例1(参见上文描述)构建文库的t碱基频率分布图。

图6为本发明和对比实施例2(参见上文描述)构建文库的t碱基频率分布图。

图7为本发明和对比实施例1(参见上文描述)构建文库的检测基因数目，图7中的重叠基因是对比实施例1和本发明构建文库检测到的相同基因。

图8为本发明和对比实施例2(参见上文描述)构建文库的检测基因数目，图8中的重叠基因是对比实施例2和本发明建库检测到的相同基因。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式进一步阐述本发明的技术特点。应注意的是，以下具体实施方式仅是示例性的，其不应视为是对本发明的限制。

本发明mrna3’末端混合建库的反转录引物包含vn碱基；优选地，所述反转录引物为96个mrna的反转录引物；更优选地，所述反转录引物选自上述表1所示的反转录引物。

本发明所述的建库方法包括如下步骤：

使用本发明的反转录引物对总rna进行反转录；

将反转录完毕的96个样本混合至一个管中，然后降解模板mrna，得到反转录的产物；

对反转录的产物进行纯化，并在纯化完成后加入二链合成酶进行二链合成；

进行文库片段大小选择，以回收150-600bp的片段；

进行pcr扩增，以富集模板dna；

用等体积的beckmanagencourtampurexpbeads纯化pcr产物，获得mrna3’末端混合文库。

实施例

材料：

取温室培养的土培材料(玉米)，生长50天时，取顶部倒2叶，用zymo的direct-zol^tmrnaminiprepplus试剂提取总rna，采用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，如图1所示，rna条带清晰，没有明显的降解，可以用于后续的建库操作中。

rna-seq3’末端文库构建流程：

合成二链合成引物以及反转录的锚定引物(所述合成由invitrogen公司进行)，然后用depc水稀释到100μm。

本发明文库构建流程：

以总rna为起始，以本发明改进的反转录引物进行反转录和文库构建，流程如下：

(1)反转录：

以总rna为起始，不进行mrna的分离，进行如下操作，使反转录引物和mrna互补结合；

取rnase/dnasefree的200μlpcr管，加入浓度100μm的反转录引物3μl，总rna7μl，混匀离心，放置于pcr仪上，运行94℃2min，迅速置于冰上，离心。

加入以下试剂，进行mrna的反转录：加入0.5mmdntp，10mmdtt，35.8uprotoscriptiireversetranscriptase(neb)，轻混离心，放置于pcr仪上，运行25℃5min，42℃1h。cdna可以于-20℃冰箱保存。

(2)降解模板mrna：

加入1μl4×exonucleasei(neb)，放置于pcr仪上，运行25℃1h；

加入20μl体积比为1∶1的naoh(1m)和edta(0.5m)的混合物，放置于pcr仪上，运行65℃15min；

加入6m盐酸中和。

(3)使用qiagenminelutepcrpurificationkit进行纯化(货号：28004)具体操作按照产品说明进行，用16μl超纯水洗脱。

(4)合成cdna的互补链：

加1μl10mm的dntp和5μl100μm二链合成引物，放置于pcr仪上，运行70℃2min，迅速放置于冰上5min；

加1μlklenowlargefragmentdnapolymerase(neb)，放置于pcr仪上，运行37℃30min；

加入edta直至cdna为50μm时终止反应。

(5)片段选择：

配置2％的琼脂糖凝胶，进行电泳，切取长度150-600bp的片段，使用qiagenminelutegelextractionkit(货号：28604)进行dna回收和纯化。

(6)pcr扩增：

将纯化产物加入nebphusion高保真酶和0.5μmilluminarp1primer和illuminaindexprimer，放置于pcr仪上，进行pcr扩增，其中扩增条件为：98℃30s；98℃，15s；62℃，15s；72℃，60s，运行10-12个循环；72℃，7min；4℃，保持。

(7)pcr产物纯化：

使用等体积的beckmanagencourtampurexpbeads(货号：a63881)进行pcr产物纯化，具体流程参照产品说明进行，最后用22μl超纯水溶，吸上清，获得文库模板dna。

对比实施例1

使用表2的未加锚定碱基(即没有vn碱基)的反转录引物进行反转录，其中文库构建实验流程与本发明上述的文库构建流程相同。

表2

对比实施例2

使用表2的未加锚定碱基(即vn碱基)的反转录引物(参见)进行反转录，其中文库构建流程参照bush文献报道(plate-seqforgenome-wideregulatorynetworkanalysisofhigh-throughputscreens，bush，e.cetal.，naturecommunications，8，doi：10.1038/s41467-017-00136-z，2017)的方法。

对上述文库进行质量检测，文库质量合格后，在illumina测序平台hiseqx10进行pe150双端测序，每个文库测序数据量0.5gb以上。文库下机数据进行过滤，去掉接头序列和低质量碱基，根据样本不同barcode标签分离样本数据，用staralignerversion2.5.3a2(star：ultrafastuniversalrna-seqaligner，dobin，a.，etal.，bioinformatics，29(1)，15-21，2012)将reads比对到玉米参考基因组(agpv4)。

结果与分析

plate-seq建库技术首先需要进行mrna的分离，以mrna为起始进行反转录，反转录引物3’端为oligo(t)，可以与poly(a)尾不同位点随机结合起始反转录，导致文库插入片段一端含有大量的t碱基，引起测序时碱基质量的下降导致数据不可用。

由图5可以看出，本发明通过加入锚定碱基(即vn碱基)，显著降低了测序读段(reads)中t碱基的比例。对比实施例1中未加入锚定碱基时，测序读段(reads)中长度20～30个连续t碱基的频率为63％，相比之下，本发明加入锚定碱基后，测序读段(reads)中长度20～30个连续t碱基的频率降低为8％，69％的测序读段(reads)中连续t碱基长度降低为20以下。

由图6可以看出，与对比实施例2(bush文献报道的plate-seq方法)相比(其中测序读段(reads)中长度20～30个连续t碱基的频率为67％)，本发明也显著降低了测序读段(reads)中t碱基的比例。

以上结果说明本发明的加入锚定碱基(即vn碱基)后的反转录引物能显著降低测序读段(reads)中t碱基的比例。

此外，对比分析本发明和对比实施例1、2的检测基因的数目，结果表明(参见图7、图8)，使用本发明的反转录引物和方法，在不同测序数据量条件下，检测基因数目平均提高20％以上。

综上所述，以上结果表明，本发明通过对反转录引物进行重新设计并对实验流程进行改进，取得了以下有益效果：①实现了直接以总rna为起始进行文库构建，简化了mrna3’末端混合建库的流程，降低了建库成本，建库成本约50元/样本，远低于plate-seq建库成本(约为200元/样本)和lexogen试剂盒的成本(约为260元/样本)；②应用本发明改进的实验流程，显著提高了文库测序数据的质量；③相同测序数据量条件下，与plate-seq方法相比，显著提高了检测基因的数目，提高了基因检测的灵敏度。