小麦copine基因TaBON1和TaBON3的抗病应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，涉及小麦copine基因tabon1和tabon3的抗病应用。

背景技术：

小麦作为主要的粮食作物之一，为全世界约1/3的人口提供主要的膳食碳水化合物。但是在其生长过程中，它的产量和质量往往受到来自各种病原体的威胁，其中由禾布氏白粉菌blumeriagraminisf.sp.tritici(bgt)引起的小麦白粉病，是全球小麦最严重的病害之一(yaoetal.,2007)。抗性小麦品种的利用是控制小麦白粉病最有效和经济的策略。因此，目前最重要的是从小麦基因组中鉴定新的白粉病抗性基因。

作为定植生物，植物在受到病原菌威胁时不能通过躲藏或逃逸来避免侵害。为了保护自己，植物进化出了至少两层先天免疫系统来防御这些潜在的入侵者(jones&dangl,2006)。第一层是病原相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,pamps)，如细菌鞭毛和几丁质等，被模式识别受体(pattern-recognitionreceptors,prrs)所感知，从而诱导触发的免疫反应，被称为pti(pamp-triggeredimmunity)(bernoux,ellis,&dodds,2011；jones&dangl,2006；segonzac&zipfel,2011；zhang&zhou,2010)。早期的防卫反应主要包括活性氧的高积累、胼胝质的沉积以及相关抗病基因表达的上调，这些反应都是为了抑制或者阻止病原菌的进一步入侵。但是一些病原菌可以通过分泌效应因子，从而抑制植物的基础防卫反应，最终达到成功入侵的目的。为了应对这些效应因子，植物进化出了第二层免疫系统，由病原菌分泌的效应因子被植物的免疫因子(r蛋白)直接或间接地识别，避免病原菌的进一步入侵，从而触发的免疫反应，被称为eti(effector-triggeredimmunity)(jones&dangl,2006)。在小麦中被鉴定抗白粉病基因已有超过50个(haoetal.,2015)，其中大部分都是基于“基因对基因”假说的小种特异性抗性基因，但是由于病原体具有很大的进化潜力，这种抗性在大面积推广时容易抗性丧失(mcdonald&linde,2002)。

copine蛋白是一类钙离子依赖性磷脂结合蛋白，在不同的物种的氨基末端均具有保守的c2a和c2b两个c2结构域，以及在羧基末端具有一个vwa结构域(vonwillebrandfactora)(creutzetal.,1998)。拟南芥中的copine蛋白bon1的c2结构域和vwa结构域分别在钙离子结合活性和蛋白与蛋白之间的互作中发挥着关键的作用(lietal.,2010)。copine基因广泛的存在于不同的物种中，zou等(2016)对16种不同的植物的copine基因的进化分析发现，开花植物中的copine基因可以分为两大分支，分别为i类和iii类。在双子叶植物拟南芥中的atbon1和atbon2属于i类，而atbon3则属于iii类(zouetal.,2016)。atbon1是nbs-lrr类免疫受体snc1(suppressorofnpr1-1,constitutive1)的负调控基因，且atbon1的功能缺失突变体bon1表现出增强的抗病性和温度依赖的生长缺陷。近期研究发现，atbon1是脱落酸和细菌病原体触发的气孔关闭的正调节因子，表明bon1在入侵前和入侵后防卫反应中具有相反的作用(gouetal.,2015)。atbon1与atbon2和atbon3具有重叠的功能，通过多个r类似基因来抑制程序性细胞死亡以及防卫反应(li,pennington,&hua,2009b)。研究发现，bon1bon2bon3的三突变体会死于过强的自体免疫(yangetal.,2006b)。尽管在拟南芥中copine基因的功能已被揭示，但是copine基因在单子叶植物，尤其是小麦中的功能仍然处于未知的状态。

技术实现要素：

本发明的目的是提供小麦copine基因tabon1和tabon3的抗白粉病应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

普通小麦copine基因tabon1在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

普通小麦copine基因tabon3在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果：

我们对普通小麦两个copine基因tabon1和tabon3的抗病功能进行了验证分析。研究发现小麦中tabon1和tabon3对病原菌的侵染以及温度的改变都会有响应。同时发现将tabon1和tabon3沉默后会提高小麦对白粉病的抗性。实验结果表明小麦中的copine基因负调控细胞程序性死亡和小麦对白粉病的抗性。

附图说明

图1copine蛋白在不同物种中的进化分析

利用mega5.02软件对拟南芥(at)，水稻(os)和小麦(ta)中copine家族的构建邻接进化树。推测的系统发育采用1000次bootstrap重复分析测试。比例尺表示分支长度。

图2tabon1和tabon3蛋白的结构域分析

smart网站中分析的tabon1和tabon3的结构域，并利用ibs1.0.2程序(http://ibs.biocuckoo.org/download.php)中进行编辑呈现。数字代表结构域的氨基酸残基或整个蛋白质中的氨基酸残基。

图3tabon1和tabon3的组织特异性表达

a,b.qrt-rcr检测tabon1(a)或tabon3(b)在不同组织中的表达，图中简写的字母r，st，yl，sl和sp分别表示根，茎，嫩叶，老叶和穗。taactin为内参。每个样品均有三个生物重复。“*”表示显著性差异(p≤0.01)。

图4tabon1和tabon3接白粉菌诱导表达

a,b.利用qrt-pcr的方法对tabon1(a)和tabon3(b)在接种白粉菌大田混合菌株后不同小时内的rna表达进行检测。taactin为内参。每个样品均有三个生物重复。“*”表示显著性差异(p≤0.01)。

图5γ-tabon1和γ-tabon3重组载体的构建

a.tabon1和tabon3重组病毒载体的模式图；b.tabon1和tabon3目的片段pcr扩增，m：2kdnamarker，1和3分别为tabon1和tabon3的目标片段；c.tabon1和tabon3重组载体质粒酶切验证，m：2kdnamarker。

图6病毒重组载体线性化

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测α，β和γ:00及病毒重组载体γ:pds，γ:tabon1和γ:tabon3的线性化纯化，marker:15kdnamarker。

图7病毒重组载体体外转录

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测α，β和γ:00及病毒重组载体γ:pds，γ:tabon1和γ:tabon3的体外转录，marker:15kdnamarker。

图8vigs表型鉴定和沉默效率检测

a.vigs8天后表型鉴定；b,c.利用qrt-pcr检测tabon1(b)和tabon3(c)的沉默效率

图9tabon1和tabon3的同源检测

a.利用半定量pcr检测tabon1沉默植株中tabon3的表达；b.利用半定量pcr检测tabon3沉默植株中tabon1的表达

图10tapr2和tapr10基因在对照及沉默植株中表达分析

a,b.利用qrt-pcr检测tapr2(a)和tapr10(b)在对照以及tabon1和tabon3沉默植株中的表达。

图11tacat和tanadphox基因在对照及沉默植株中表达分析

a,b.利用qrt-pcr检测tacat(a)和tanadphox(b)在对照及tabon1和tabon3沉默植株中的表达。

图12沉默植株组织学表型观察

a.利用dab染色检测对照及沉默植株在无菌条件下h2o2的积累；b.利用台盼蓝染色检测对照及沉默植株在无菌条件下的细胞死亡。

图13接种bgt后5天表型鉴定

对照以及沉默植株在接种白粉菌5天后的表型，红色箭头：细胞死亡出现的位置

图14接种bgt后沉默植株组织学表型观察

a.利用dab染色检测接种白粉菌3天后的对照以及沉默植株中h2o2的积累；b,c,d.利用台盼蓝染色检测在接种白粉菌24h(b)，48h(c)和72h(d)后对照及沉默植株中细胞死亡的积累。

具体实施方式

实施例1

1.1植物材料与处理

感白粉病的六倍体普通小麦(triticumaestivuml.aabbdd)苏麦3号由南京农业大学王秀娥实验室提供。在培养箱中培养小麦，培养条件为20℃或22℃或25℃或28℃或32℃，长日照条件，16h(hour,h)光照/8h黑暗，湿度60％。

温度诱导实验采用22℃、25℃和32℃三个温度。将在22℃培养箱生长至两周龄大小的幼苗，在光照和湿度不变的条件下，分别移至25℃和32℃。处理5天后，对任意3株长势一致小麦的苗的叶片进行混合取样。

白粉菌bgt接菌处理实验，同样采用22℃生长两周的小麦，接菌0h、1h、2h、4h，8h、12h、24h、36h和48h后取任意3株苗的叶片，混合在一起。以上样品的取样均用锡箔纸包裹后于液氮中速冻，最后置于-80℃中保存。

组织特异性表达分析实验，采用22℃生长两周的小麦，任意取3株苗的根，茎，叶(嫩叶)，混合在一起。采用22℃生长一月的小麦，任意取3株苗的第3-4叶(老叶)，混合在一起。采用22℃生长至抽穗的小麦，任意取3株苗的穗(穗)，混合在一起。以上样品的取样均用锡箔纸包裹后于液氮中速冻，最后置于-80℃中保存。

1.2病原菌的培养

本实验使用的白粉菌菌种是来自江苏省南京地区的大田混合菌种。菌种由南京农业大学王秀娥实验室提供。病原菌的繁殖以苏麦3号为寄主，采用抖落法，于20℃/18℃，16h光照/8h黑暗，湿度80％的菌室中隔离繁殖。该菌室由南京农业大学王秀娥实验室提供。

1.3多重序列比对，结构域分析以及进化树的构建

全长的copine蛋白序列来自于ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，tair(http://www.arabidopsis.org/)，gramene(http://www.gramene.org/)和phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。保守结构域使用smart网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行在线预测。

多序列比对采用copine蛋白的保守区域，即从c2a结构域起始位点序列至vwa结构域末尾点序列。利用mega5.02软件(http://www.megasoftware.net/history.php)，在默认参数下进行，之后再将比对的结果在genedoc(http://www.softpedia.com/get/science-cad/genedoc.shtml)软件中进行再次编辑。

进化树分析采用copine蛋白的全长序列，在mega5.02软件中进行copine家族的蛋白序列分析，再利用双缺失1000次重复bootstrap的邻接法(neighbor-joining,nj)构建进化树。

由于在拟南芥中的copine基因在抗病防卫过程中发挥重要的作用，因此我们预测双子叶植物小麦中的copine基因可能也与抗病性调控有关。为了鉴定小麦中的copine基因，我们利用拟南芥中atbon1的cdna序列在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中比对小麦的基因组序列，其中发现了两个与atbon1具有66-68％序列相似的候选基因(序列id号分别为：ak334076.1和ak330585.1)，我们将其暂命名为tabon1和tabon3。利用(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show＝blast&method＝org_taestivum_er)网站对其染色体位置的分析发现，tabon1的两个同源拷贝分别位于6as和6bl上，因此我们将其分别命名为tabon1-a和tabon1-b，而tabon3的三个同源拷贝分别位于1al，1bl和1dl上，我们同样也分别将其命名为tabon3-a，tabon3-b和tabon3-d。利用拟南芥，水稻和小麦的copine蛋白序列进行进化分析发现，tabon1与osbon1(os02g0521300)的亲缘关系更接近，序列保守高达86％，而tabon3则与osbon3(os05g0373300)的亲缘关系更为接近，序列保守高达82-85％(图1)。在开花植物中的copine蛋白具有i和iii类两个分支(zouetal.,2016)，对tabon1和tabon3的进化分析发现，tabon1属于i类分支，tabon3则属于iii类分支。

对数据库中预测出的tabon1的两个同源拷贝tabon1-a和tabon1-b以及tabon3的三个同源拷贝tabon3-a、tabon3-b和tabon3-d的结构域分别进行分析。发现这五个同源拷贝均具有copine蛋白共有的两个c2结构域以及一个vwa结构域(图2)。

实施例2tabon1和tabon3的表达模式分析

2.1tabon1和tabon3在小麦中的组织特异性表达分析

利用实时荧光定量pcr(quantitativereverse-transcriptionpolymerasechainreaction,pcr)分析tabon1和tabon3基因在小麦的根、茎、嫩叶、老叶和穗中的表达情况。植物中总rna的提取根据takara公司trizol试剂盒的使用说明书进行，于-80℃保存备用。第一条cdna链的合成使用vazyme公司的transcript1^ststrandcdnasynthesis试剂盒。本实验通常反转500ng的rna样品。随后cdna用于tabon1和tabon3的实时荧光定量pcr(qrt-pcr)。qrt-pcr使用cfx96实时pcr系统进行，由国家重点实验室提供。

结果发现，tabon1和tabon3在不同的组织中均有表达，其中在嫩叶中的表达最高，其次是茎，在根中表达最低(图3)。由于特异性引物只能区分不同基因tabon1和tabon3，并不能区分它们的同源拷贝，所以实验检测的tabon1包括tabon1-a和tabon1-b，tabon3包括tabon3-a，tabon3-b和tabon3-d。

2.2接种白粉菌bgt诱导tabon1和tabon3上调表达

为了研究tabon基因在小麦抗病中的作用，我们对苗龄两周的小麦进行白粉病病原菌bgt的接种，对不同时间点的表达情况利用qrt-pcr进行了分析(图4)。结果表明，tabon1和tabon3均会被bgt诱导上调表达。在接种bgt4h内，tabon1的表达量从2倍上升到11倍，而tabon3的表达量则上调到9倍，且两者的表达均在4h达到最高，在之后的时间段内两者表达均逐渐降低，在24，36和48h基本回到初始水平。

实施例3vigs系统对tabon1和tabon3基因进行功能验证

3.1沉默重组载体的构建

对预测的tabon1和tabon3的cdna序列，分别选取tabon1的194bp和tabon3的224bp的cdna片段，根据两者的序列分别设计特异性引物，并且在正向和反向引物的5’端分别加上paci和noti两个酶切位点以及保护碱基，确保目标片段为反向插入载体中，以苏麦3号的cdna为模板进行pcr扩增片段。目标片段进行切胶回收后，连接到t载体上转化大肠杆菌dh5α后，对阳性克隆摇菌测序。测序结果运用bioxm软件检测序列正确性。

将测序正确的质粒以及γ载体质粒分别用paci和noti进行酶切。酶切体系为：cutsmartbuffer，5μl；paci，0.1μl；noti，0.1μl；plasmiddna，1μg；h2oupto50μl。37℃过夜酶切。

对酶促反应液进行过柱纯化，并利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收后目标片段和载体片段的浓度。

回收后目标片段与载体片段进行连接，连接体系为：10×t4ligationbuffer，1μl；目标片段，15ng；载体片段，50ng；t4dnaligase，1μl；h20upto10μl，16℃过夜连接。

小麦中的vigs系统由bsmv介导。bsmv由三条rna单链组成，分别是α、β和γ(图5)。构建沉默重组载体时，将目标基因片段融合到γ质粒上。本实验选取tabon1的194bp的cdna片段和tabon3的224bp的cdna片段，根据两者的序列分别设计特异性引物，并且在正向和反向引物的5’端分别加上paci和noti两个酶切位点以及保护碱基。确保目标片段为反向插入载体中，以苏麦3号的cdna为模板进行pcr扩增片段。目标片段进行切胶回收后，连接到t载体上进行测序。将测序正确的质粒以及γ载体质粒分别用paci和noti进行酶切，过柱纯化目标片段和γ载体，将两者连接后进行转化，获得阳性单克隆，将其摇菌提取质粒，将其分别命名为γ-tabon1和γ-tabon3。并对其分别进行酶切验证，图5表明，tabon1和tabon3已成功连接到γ质粒上。vigs载体已成功构建可进行下一步线性化实验。

3.2病毒及重组载体的线性化

将α、γ:00(后命名为bsmv:00)以及病毒重组载体γ-tabon1和γ-tabon3分别用mlui进行线性化酶切，β载体用spei进行线性化酶切。酶切体系：10×hbuffer/10×mbuffer，5μl；plasmiddna，2μg；mlui/spei，2μl，depc水upto50μl。37℃过夜酶切后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测效果。对酶促反应液进行纯化，浓度为300ng/μl。

图6可以看出，仅有一条在6000bp左右清晰且无拖尾的条带，说明载体已被成功线性化，过柱回收后浓度保持在300ng/ul则可进行下一步实验。

3.3体外转录反应

将线性化后的载体按照ribomax^tmlargescalernaproductionsystem-sp6和t7的说明书操作进行rna的体外转录。转录体系：t7transcription5×buffer，5μl；γntps，3μl；线性化质粒，3μl；ribom7gcapanalog，0.75μl；enzymemix(t7)，1μl；depc水，0.25μl。37℃孵育4h，1％的琼脂糖凝胶电泳检测效果，-80℃保存备用。结果见图7，可以看出，在1000-2000bp范围内有很亮的一条带，则说明已经成功的完成体外转录，可用于之后的实验。

3.4转录产物的混合及转染

将α，β以及γ:00/γ重组载体的转录物按1：1：1的比例等体积混合共30μl，加入90μl的depc水，然后再加入120μl的2×gkpbuffer(50mmglycine,30mmk2hpo4,ph9.2,1％bentonite,1％celite)得到病毒混合液。正常条件下生长两周的幼苗用于病毒接种。将病毒混合物用手指夹住从二叶的基部开始轻轻的摩擦三次，bsmv:tapds和bsmv:00为阳性对照。三种混合病毒各接种50株幼苗，mock仅用2×gkpbuffer接种30棵幼苗作为阴性对照。于23℃左右温度下黑暗保湿培养24h，之后分别转至22℃或28℃培养条件下进行恢复。

3.5沉默植株的沉默效率检测及离体鉴定

接种病毒14天后，将出现病毒表型的沉默植株的四叶，包括阳性对照和mock，提取rna，并用qrt-pcr进行沉默效率检测，同时将剩余的四叶离体于6-ba培养基上，用抖落法接种高密度新鲜的混合白粉菌。5天后观察拍照记录。

将转录产物混合对两周苗龄的小麦进行体外转染8天后，发现bsmv:pds、bsmv:00、bsmv:tabon1或bsmv:tabon3的沉默植株的第三片叶子均出现褪绿的表型(图8)，说明病毒已成功侵染。转染14天后，利用qrt-pcr对bsmv:00、bsmv:tabon1或bsmv:tabon3中tabon1或tabon3的第四片叶子沉默效率进行检测。图8结果表明，与病毒空对照bsmv:00相比，bsmv:tabon1或bsmv:tabon3沉默植株中tabon1或tabon3的表达水平均降低了80-90％。说明vigs系统在本实验中是可行的，可用于之后对基因功能的研究。

本实验利用半定量pcr在bsmv:tabon1沉默植株中检测了tabon3的表达水平，以及bsmv:tabon3沉默植株中检测了tabon1的表达水平(图9)，结果表明在tabon1沉默植株中tabon3的表达并不会受到影响，且在tabon3沉默植株中tabon1的表达也同样不受影响，说明本实验的vigs体系是有特异性的，可用于tabon1和tabon3的功能分析。

3.6tabon1和tabon3的沉默会诱导pr基因的上调表达

拟南芥中atbon1的缺失会使植物产生自体免疫，且会诱导抗病相关的pr基因的上调表达(yang&hua,2004)。tapr2被认为与h2o2的积累相关，是sa通路的标志基因之一，tapr10则具有核糖核苷酸酶的活性，与病毒rna的降解相关。通过qrt-pcr检测发现，与对照bsmv:00沉默植株相比，在tabon1或tabon3的沉默植株中tapr2表达上调4倍或3倍，而tapr10则上调5倍或2倍(图10)，说明tabon1和tabon3的沉默在一定程度上促进sa信号途径的转导和h2o2的积累。

3.7tabon1和tabon3的沉默会诱导ros标志基因的上调表达

拟南芥中功能缺失突变体bon1的自体免疫会伴随着较高的ros的积累和细胞死亡(bao,yang,&hua,2013)。tacat基因与ros清除相关，tanadphox基因参与催化超氢化物的产生。通过qrt-pcr检测这两个标志基因的表达发现，在tabon1和tabon3沉默植株中，tacat和tanadphox均被诱导上调表达(图11)，说明tabon1和tabon3的沉默一定程度上会促进ros的积累。

3.6.8tabon1和tabon3基因沉默后的组织学表型分析

对tabon1或tabon3沉默植株分别用3,3-二氨基联苯胺(dab)和台盼蓝染色检测h2o2和细胞死亡(图12)。研究发现，tabon1或tabon3沉默植株的染色与对照bsmv:00植株相比，并无明显的表型差别，说明这可能是因为相关的基因的上调表达并不足以诱发植物发生h2o2和细胞死亡水平的改变。

3.6.9接种bgt后沉默植株的表型观察及组织学表型观察

病毒体外转染14天后，对mock以及bsmv:00、bsmv:tabon1或bsmv:tabon3的沉默植株接种白粉菌大田混合菌株。对其表型进行观察发现，在接种bgt5天后，bsmv:tabon1或bsmv:tabon3的沉默植株叶片上有过敏性坏死病斑的出现，且只有少量的孢子生长，而对照mock以及bsmv:00植株叶片上并无坏死病斑的产生，且有较多的孢子生长(图13)。

同时对接种病原菌bgt3天后的沉默植株及其对照植株分别进行dab染色，结果显示，相对于bsmv:00对照植株，tabon1和tabon3沉默植株较之于0天(图12)出现较多的h2o2积累(图14)。

利用台盼蓝对接种病原菌bgt24h、48h和72h的沉默植株及其对照植株的细胞程序性死亡检测。实验结果发现，接种bgt24h后，tabon沉默植株的细胞死亡积累迅速增加，此时对照bsmv:00植株的细胞死亡与0h相比(图12)并无明显变化。但是接种bgt48和72h后，tabon沉默植株和对照植株中均有很高的细胞死亡积累，两者之间并没有明显的差异(图14)。在bgt感染后而不是感染前，tabon1或tabon3沉默植物的ros和细胞死亡积累比对照植物多(图14)。因此，tabon1或tabon3沉默植物的较高抗性的表型可能与植物内作为增强防御反应主要组成部分的ros积聚和细胞死亡的增强作用相关。