启动子和重组载体及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种启动子和重组载体及其应用。

背景技术：

atrd22是拟南芥中的一个burp-domain蛋白基因。目前的研究表明，该基因在组织水平上的表达具有一定的特异性。如有报道显示，atrd22基因在拟南芥花和种子发育的早、中期大量表达，在aba(abscisicacid，脱落酸)处理、干旱和盐胁迫时也可诱导atrd22在地上部表达(yamaguchi-shinozaki&shinozaki，1993)。harshavardhan等(2014)也报道，atrd22只在地上部表达。但这些研究均未进一步的对控制atrd22表达的序列片段长短和特性进行分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种启动子和重组载体及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种启动子，所述启动子含有如seqid:no1所示的核苷酸序列，或如seqidno:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列。

本发明另一方面提供一种重组载体，所述重组载体含有本发明的上述启动子。

相应地，本发明提供一种上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：

扩增本发明所述的启动子；

扩增atrd22基因片段；

将所述atrd22基因片段与质粒pcambia-1301分别进行第一双酶切处理，然后使atrd22基因片段插入到所述质粒pcambia-1301中以替换掉35s启动子片段，得到中间载体；

将所述中间载体和所述启动子分别用进行第二双酶切处理，然后使所述启动子插入到所述中间载体中以替换掉atrd22片段，得到所述重组载体。

最后，本发明提供一种本发明所述的启动子或本发明所述的重组载体以及本发明所述的制备方法得到的重组载体，在制备转基因作物中的应用。

本发明的启动子中的seqid:no1取自atrd22基因转录起始位点上游的2000bp片段(本发明中命名为rdp)，通过分析该序列中的顺式作用元件，发现rdp中存在响应组织器官特异性表达有关的元件；通过分析和试验验证，含有该rdp片段的启动子可引导目的基因特异性地在植物地上部表达，因此该启动子以及含有该启动子序列的重组载体可以适用于特定的转基因植物的生产，可使待转入的目的基因只在作物(如植物)地上部表达而不在根中表达的转基因作物生产，如一些以收获根为主要产品的作物，如番薯、马铃薯等。因此，因该启动子特有的性能，本发明提供的启动子或本发明所述的重组载体以及本发明所述的制备方法得到的重组载体具有在制备转基因作物中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例2中atrd22基因在拟南芥幼苗的根和叶中的表达电泳图；

图2为本发明实施例3中pcambia1301表达载体结构示意图；

图3为本发明实施例3中pcambia1301-rdpro-gus菌落pcr电泳图；其中，m：marker；1-7：单菌落；

图4为本发明实施例3中pcambia1301-rdpro-gus载体双酶切电泳图；其中，m：marker；1：1号单菌落；4：4号单菌落；5：5号单菌落；

图5为本发明实施例4中rdp-gus转基因植株筛选结果图；其中，a：1/2ms培养基中的野生型拟南芥；b：在含有30mg/lhyg的筛选培养基中的野生型拟南芥；c：在含有30mg/lhyg的筛选培养基中的rdp-gus转基因拟南芥，箭头所示为转基因阳性植株；

图6为本发明实施例5中gus染色的拟南芥幼苗图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种启动子，所述启动子含有如seqid:no1所示的核苷酸序列，或如seqidno:1所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的核苷酸序列。

进一步地，本发明实施例的启动子为seqidno:1，序列如下：

aaactatttgaaccaaaatcaacaacattaaatacataggtgttcactcattctccaaccatggattgatgaaacaaaataatatcgaaaataatgatgaaaacgaatgaatattggtgagccataaatgagttggttgttcgttttaatttctctttgtctgaaaagtccacacgaaagttaagattaccagatcccccacactcttttggttttgcttttgaacatattctcgatcgaagtgaaaaaatttcttcggcacatgacactgaagtaccgtcgaaacatgccaacgggcaacgaccgtccatcattattagtagtttgattttgatataattaattgatattttaaaattaagatatcggaaaagaaaaataaatattcaaagaataaagtaaaataattatcatttttaataactttcttacttctaaaacttactctcattataatcctcctatatttaatacacaaattatgttgttatgccatattttgttttcagattaaaatgtttttattgaaaatcttctaattactatatattgttataatgtatctacgttgtaatgtgaatctaagctttttaaaatttgaaaacattaatttttgtacaaaaataaaataagtattactccctatgtttctatatatatgatgtttgggttaaacgcaactatcatttaatactgtagttttaaaaattcaaccaatcacaaaagagatggtataatctaaaaagtcataaaatcaatacatttaaaatttgtattgaaacttgtaaaatagcttatataatgaaacaaaataaaaacactataacatcctatataatgaaacagagaaagtattattaatagctatctaccgcgtttaactatcacactaagcttgatcgatagattgagtcagagtggtactaaaatcctaattatatatattggatgcatgagaagtttctttaaagatgtaatctatttcaaataattatttggaatatggccaattttgttagttcattgaaacgtcaactttttacttgcaaccactttgtaggaccattaactgcaaaataagaattctctaagcttcacaaggggttcgtttggtgctataaaaacattgttttaagaactggtttactggttctataaatctataaatccaaatatgaagtatggcaataataataacatgttagcacaaaaaatactcattaaattcctacccaaaaaaaatctttatatgaaactaaaacttatatacacaataatagtgatacaaagtaggtcttgatattcaactattcgggattttctggtttcgagtaattcgtataaaaggtttaagatctattatgttcactgaaatcttaactttgttttgtttccagttttaactagtagaaattgaaagttttaaaaattgttacttacaataaaatttgaatcaatatccttaatcaaaggatcttaagactagcacaattaaaacatataacgtagaatatctgaaataactcgaaaatatctgaactaagttagtagttttaaaatataatcccggtttggaccgggcagtatgtacttcaatacttgtgggttttgacgattttggatcggattgggcgggccagccagattgatctattacaaatttcacctgtcaacgctaactccgaacttaatcaaagattttgagctaaggaaaactaatcagtgatcacccaaagaaaacattcgtgaataattgtttgctttccatggcagcaaaacaaataggacccaaataggaatgtcaaaaaaaagaaagacacgaaacgaagtagtataacgtaacacacaaaaataaactagagatattaaaaacacatgtccacacatggatacaagagcatttaaggagcagaaggcacgtagtggttagaaggtatgtgatataattaatcggcccaaatagattggtaagtagtagccgtctatatcatccatactca。

本发明实施例的启动子中的seqid:no1取自atrd22基因转录起始位点上游的2000bp片段(命名为rdp)，通过分析该序列中的顺式作用元件，发现rdp中存在响应组织器官特异性表达有关的元件，如与胚乳特异性表达相关的-300element；与种子特异性表达有关的ryrepeatbnnapa；与叶绿体基因表达有关的-10pehvpsbd；与基因在叶肉中的表达有关的cactftppca1，而且该元件数量较多，这些分析结果与atrd22在地上部的表达情况基本符合。同时，我们发现这个片段中还有十几个与基因在根中的差异表达有关的rootmotiftapox1元件。

有研究显示，rootmotiftapox1与基因在根中的特异性表达有关，li等(2010)对番茄根特异表达基legrp2启动子的研究表明，该启动子中的9个rootmotiftapox1元件可调控gus(β-glucronidase，β-葡萄糖苷酸酶)基因在不同发育期的转启动子基因拟南芥的根部表达。zhang等(2016)发现烟草ntrel1基因只在根部表达而在叶片和茎部不表达，该启动子中有6个rootmotiftapox1元件，调控了ntrel1基因在根部表达。本研究发现rdp片段序列中十几个rootmotiftapox1元件，但并未调控atrd22在根部中特异性表达，相反，rdp驱动的报告基因明显的不在根中表达。因此首次发现了该rdp片段作为启动子的特殊作用。

具体地，所述启动子在植物中引导目的基因特异性地在地上部表达而不在根部表达。进一步地，所述启动子在植物中引导目的基因在地上部输导组织中表达。

另一方面，本发明实施例提供一种重组载体，所述重组载体含有本发明实施例的上述启动子。

本发明实施例首先发现atrd22基因仅在拟南芥幼苗的叶中表达在根中不表达；通过克隆atrd22转录起始位点前2000bp的片段rdp，构建含有该启动子的重组载体，具体地，构建rdp-gus(β-glucronidase，β-葡萄糖苷酸酶)的植物表达载体pcambia1302-rdp-gus；利用农杆菌将该植物表达载体转化拟南芥，获得由rdp驱动gus表达的转基因拟南芥；对拟南芥幼苗进行gus表达分析，证明gus仅在其地上部表达不在根中表达。

含有该rdp片段序列的重组载体可以适用于特定的转基因植物的生产：以rdp片段的启动子下游连接有目的基因，待转入目的基因只在植物地上部表达而不在根中表达的转基因植物生产。比如：一些以收获根为主要产品的作物，如番薯、马铃薯等，在一实施例中，该重组载体中的所述目的基因包括抗虫基因、抗除草剂基因、抗真菌基因、抗细菌基因和抗病毒基因中的至少一种。通过驱动抗虫基因、抗除草剂基因等目的基因的表达，使其在生长过程中地上部具有抗虫、抗除草剂的能力，而收获的农产品不含转基因产物。

相应地，本发明提供一种重组载体的制备方法，包括如下步骤：

扩增本发明实施例所述的启动子；

扩增atrd22基因片段；

将所述atrd22基因片段与质粒pcambia-1301分别进行第一双酶切处理，然后使atrd22基因片段插入到所述质粒pcambia-1301中以替换掉35s启动子片段，得到中间载体；

将所述中间载体和所述启动子分别用进行第二双酶切处理，然后使所述启动子插入到所述中间载体中以替换掉atrd22片段，得到所述重组载体。

本发明的上述制备方法中，因第一酶切处理所用酶在启动子区段存在，因此不能直接将启动区进行酶切插入，通过先插入一个atrd22基因片段在载体中，然后再用本发明实施例的启动子序列重新替换atrd22基因片段，这样间接插入启动子得到本发明实施例的重组载体。

进一步地，可以从拟南芥的基因组dna中扩增atrd22基因片段和启动子，用takaraminibestplantgenomicdnaextractionkit提取拟南芥的基因组dna，用trizol法提取拟南芥总cdna。以基因组dna为模板，扩增所述启动子的引物如seqidno:2和seqidno:3所示；扩增所述atrd22基因片段的引物如seqidno:4和seqidno:5所示。

更进一步地，所述第一双酶切处理用的酶为quickcut^tmhindⅲ和quickcut^tmncoi；所述第二双酶切处理用的酶为quickcut^tmsacⅰ和quickcut^tmbln。

最后，本发明实施例提供一种本发明实施例所述的启动子或本发明实施例所述的重组载体以及本发明实施例所述的制备方法得到的重组载体，在制备转基因作物中的应用。所述转基因作物以收获根为主要产品的作物，如番薯、马铃薯等。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1启动子序列的获得及分析

在拟南芥基因组数据库tair中(http://www.arabidopsis.org/)寻找atrd22基因，并获得该基因转录起始位点上游2000bp的核苷酸序列，并将该序列片段命名为rdp。通过在线植物转录元件分析工具place对该片段序列进行分析，预测其中存在的顺式作用元件。

通过分析发现，rdp片段中存在响应组织器官特异性表达有关的元件：如-300element与胚乳特异性表达相关；ryrepeatbnnapa与种子特异性表达有关；-10pehvpsbd与叶绿体基因表达有关；cactftppca1，数量较多，与基因在叶肉中的表达有关；rootmotiftapox1与基因在根中的差异表达有关。这些元件的存在说明atrd22基因的表达可能具有组织特异性。

此外还有一些与逆境胁迫诱导响应相关的元件，表1即为atrd22基因启动子中与组织特异性相关的顺式作用元件。

表1

实施例2拟南芥幼苗中atrd22基因的表达

利用半定量pcr对拟南芥幼苗中atrd22组织特异性表达进行分析，所用引物为：

rd22-f：ccgaattcatggcgattcgtcttcctctgatc；

rd22-r：gatgcggccgcctagtagctgaaccacacaac；

actin2-f：tcttgaccttgctggacg；

actin2-r：caaacgagggctggaaca。

图1为atrd22基因在拟南芥幼苗的根和叶中的表达的半定量pcr的电泳图，通过分析根和叶中基因的表达发现，atrd22基因只在叶中表达，在根中不表达。

实施例3启动子的克隆以及载体的构建

将rdp片段连入pcambia-1301载体(图2所示)中，替换载体中的35s启动子并与gus基因相连。但由于载体中的35s启动子片段后只有ncoⅰ和bglⅱ这两个酶切位点，而rdp片段中也含有这两酶切位点，因此通过插入一段带有blnⅰ酶切位点的atrd22基因，替换了载体中35s启动子，构成中间载体，再利用中间载体中新的blnⅰ酶切位点，插入rdp片段。

具体操作：将野生型拟南芥(columbia生态型)种子灭菌消毒后播撒到1/2ms平板上进行培养，两周后长出幼苗，用takaraminibestplantgenomicdnaextractionkit提取拟南芥的基因组dna，用trizol法提取拟南芥总cdna。以基因组dna为模板，用表2中的引物rdpro-f(seqidno:2)和rdpro-r(seqidno:3)扩增atrd22基因转录起始位点前2000bp的片段，获得启动子rdp片段。同时利用拟南芥总cdna为模板用表2中的引物pcard-f(seqidno:4)/pcard-r(seqidno:5)扩增带有blnⅰ酶切位点的atrd22基因片段。用快切酶quickcut^tmhindⅲ和quickcut^tmncoi对atrd22基因片段和质粒pcambia-1301分别进行双酶切，将atrd22基因片段插入到pcambia-1301替换掉35s启动子片段。再对中间载体pcambia1301-rd22-gus和rdp片段分别用快切酶quickcut^tmsacⅰ和quickcut^tmblnⅰ进行双酶切，将rdp片段插入到中间载体替换掉atrd22片段。构建重组质粒pcambia1301-rdp-gus，并测序验证。

表2

将构建好的pcambia1301-rdp-gus载体转化到大肠杆菌dh5α中并进行菌落pcr鉴定(使用引物rdpro-f，rdpro-r)，如图3所示，扩增出了2000bp大小的片段，与rdp片段大小一致；挑选出有条带的菌落提取阳性菌落质粒，用sacⅰ和blnⅰ对质粒载体进行双酶切鉴定，如图4所示，能切除2000bp大小的条带，与预期酶切片段大小一致。测序分析表明，该序列与rdp序列一致，构建成功重组载体pcambia1301-rdp-gus。

实施例4

拟南芥转化以及转基因植株筛选

利用花序侵染法(zhangx,henriquesr,lins,etal.agrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.natureprotocols,2006,1(2):641-646.)将pcambia1301-rdp-gus重组质粒转化到农杆菌gv3101中并侵染拟南芥，收获侵染转化后的t0代种子进行转基因植株的筛选。

将种子消毒灭菌后均匀播在含有30mg/lhyg(hygromycin，潮霉素)的筛选培养基上生长约1-2周，筛选结果如图5所示：c即在含有30mg/lhyg的筛选培养基中的rdp-gus转基因拟南芥，选出叶片较大且绿，有根长出的幼苗作为阳性转基因候选植株。在t1和t2代对候选植株再次进行抗生素hyg的筛选和dna鉴定(利用扩增gus的引物gus-f和gus-r进行pcr扩增)后，获得纯合转基因植株。

实施例5

rdp驱动的报告基因gus的表达分析

将实施例4中筛选出的转rdp-gus植株在1/2ms培养基上培养10天后，进行gus染色(jeffersonra,kavanaghta,bevanmw.gusfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants[j].theembojournal,1987,6(13):3901-3907)，结果如图6所示：从图中可知，gus明显在拟南芥幼苗的地上部表达，在根中不表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳大学

<120>启动子和重组载体及其应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2000

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>1

aaactatttgaaccaaaatcaacaacattaaatacataggtgttcactcattctccaacc60

atggattgatgaaacaaaataatatcgaaaataatgatgaaaacgaatgaatattggtga120

gccataaatgagttggttgttcgttttaatttctctttgtctgaaaagtccacacgaaag180

ttaagattaccagatcccccacactcttttggttttgcttttgaacatattctcgatcga240

agtgaaaaaatttcttcggcacatgacactgaagtaccgtcgaaacatgccaacgggcaa300

cgaccgtccatcattattagtagtttgattttgatataattaattgatattttaaaatta360

agatatcggaaaagaaaaataaatattcaaagaataaagtaaaataattatcatttttaa420

taactttcttacttctaaaacttactctcattataatcctcctatatttaatacacaaat480

tatgttgttatgccatattttgttttcagattaaaatgtttttattgaaaatcttctaat540

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gatgtttgggttaaacgcaactatcatttaatactgtagttttaaaaattcaaccaatca720

caaaagagatggtataatctaaaaagtcataaaatcaatacatttaaaatttgtattgaa780

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aaacagagaaagtattattaatagctatctaccgcgtttaactatcacactaagcttgat900

cgatagattgagtcagagtggtactaaaatcctaattatatatattggatgcatgagaag960

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tctggtttcgagtaattcgtataaaaggtttaagatctattatgttcactgaaatcttaa1380

ctttgttttgtttccagttttaactagtagaaattgaaagttttaaaaattgttacttac1440

aataaaatttgaatcaatatccttaatcaaaggatcttaagactagcacaattaaaacat1500

ataacgtagaatatctgaaataactcgaaaatatctgaactaagttagtagttttaaaat1560

ataatcccggtttggaccgggcagtatgtacttcaatacttgtgggttttgacgattttg1620

gatcggattgggcgggccagccagattgatctattacaaatttcacctgtcaacgctaac1680

tccgaacttaatcaaagattttgagctaaggaaaactaatcagtgatcacccaaagaaaa1740

cattcgtgaataattgtttgctttccatggcagcaaaacaaataggacccaaataggaat1800

gtcaaaaaaaagaaagacacgaaacgaagtagtataacgtaacacacaaaaataaactag1860

agatattaaaaacacatgtccacacatggatacaagagcatttaaggagcagaaggcacg1920

tagtggttagaaggtatgtgatataattaatcggcccaaatagattggtaagtagtagcc1980

gtctatatcatccatactca2000

<210>2

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gagctcaaactatttgaaccaaaatcaacaacattaaatacataggtg48

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cctaggtgagtatggatgatatagacggctactacttaccaatc44

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aagcttatggcgattcgtcttcctctgatc30

<210>5

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

catgccatggcctaggctagtagctgaaccacacaac37