体内DNA无缝组装方法与流程

本发明属于分子生物学领域，更具体地，本发明涉及体内dna无缝组装方法。

背景技术：

dna组装技术是合成生物学实现各种目标的重要环节及关键步骤。根据组装时所处的环境，dna组装可分为体内组装和体外组装。体外组装最常见的就是用限制性内切酶和连接酶来完成的方法。但是这种方法对于多基因或者大片段的组装是不行的，因为受到限制性内切酶识别位点的限制。最近这些年发展起来的体外组装技术归类主要有：①连接酶链式反应与pcr的结合(lcr-pcr)；②重叠多片段短核苷酸与pcr的结合，该方法类似于重叠延伸pcr(oe-pcr)；③利用同尾酶酶切连接技术，包括biobrick、bglbrick和ibrick等；④利用iis限制性内切酶或其他酶辅助的dna组装技术，如goldengate组装法、master连接法、user克隆等；⑤配对选择组装法(psa)；⑥利用特殊的重组酶来完成的dna组装，如gateway、in-fusion等；⑦依赖dna聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性来完成的dna组装技术，如slic、gibson恒温组装法等。

体内dna组装方法相对要少很多，根据不同的宿主目前主要有这么几类：①以酵母为宿主的方法：主要是利用酵母自身体内所具有的重组功能，可以实现多个dna片段在酵母体内一步完成组装。gibson体内组装法、dnaassembler、体内迭代法等都是利用了酵母体内的重组功能。但是酵母可能对大肠杆菌复制子进行修饰，导致组装后的载体无法工作。②以枯草芽孢杆菌为宿主的方法：在枯草芽孢杆菌体内进行dna组装主要是日本科学家itaya实验室建立起来的，他们使用bacillussubtilis168基因组(4.2mb)作为克隆载体(bgm)，首先将光合细菌synechocystispcc6803染色体上间隔排列的多段序列lps(每段约5kb)克隆到lpa质粒，然后通过同源重组将lps序列整合到bgm上，然后再次进行同源重组，将synechocystispcc6803染色体上大约30kb的序列整合到bgm上，随后再将另外一个lpa质粒上的lps序列整合到bgm上，然后将紧邻synechocystispcc6803染色体上另外一段约30kb的序列整合到bgm上，依次迭代，将光合细菌synechocystispcc68033.5mb的染色体克隆到bgm上。但是该方法需要100kb以上的dna片段作为模板，其应用很受限。随后，他们改变了策略，首先通过pcr将染色体上相互重叠的序列(约4-6kb)克隆到质粒pcisp401和pcisp402上，然后再通过pcr从质粒上将要整合的序列克隆下来，并在两侧带上了同源臂，然后再通过同源重组将各个片段依次拼接在bgm上，通过这样的方法，将小鼠线粒体基因组(16.3kb)和水稻叶绿体基因组(134.5kb)组装成功。③以大肠杆菌为宿主的方法和酵母及枯草芽孢杆菌不同，线性dna序列并不容易直接转化进e.coli，因为atp依赖的外切酶recbcd能够消化掉线性dna片段。在e.coli中，通常用λred重组酶系统和recet重组系统来进行同源重组。λred重组酶系统更加适合线性和环状dna之间的重组，而recet重组系统更加适合两个线性dna片段之间的重组。对于dna片段整合到e.coli染色体上，随着dna片段长度的增加，整合的效率会大幅度降低，kuhlman等人设计了一种系统，利用red重组系统和i-scei内切酶，可以最大将7kb的dna片段一次整合到e.coli染色体上。但该方法需要使用三个质粒，两次转化，用的时间也较长。

综上，本领域中还需要进一步研究更为简便，易于操作的方法，来提高dna体内组装效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种体内dna无缝组装方法。

在本发明的第一方面，提供一种dna无缝组装方法，所述方法包括：

(1)扩增获得基因a的序列，其5’端加上其上游同源序列；在其3’端加上一段与基因b的5’端相同的序列片段1；

(2)扩增获得teta的序列，在其5’端加上(5’→3’)i-scei识别序列及一段与基因b的5’端相同的序列片段2，以及i-scei识别序列；在其3’端加上(5’→3’)i-scei识别序列及与基因b的5’端相同的序列片段3；

(3)扩增获得基因b的序列，其3’端加上其下游同源序列；

(4)将前述步骤(1)～(3)获得的扩增产物混合作为模板，进行pcr，获得“基因a-teta-基因b”序列；

(5)在宿主细胞中诱导表达red重组系统，将步骤(4)获得的“基因a-teta-基因b”序列转入宿主细胞，使“基因a-teta-基因b”序列整合到染色体上；

(6)诱导表达red重组系统以及该系统中的i-scei限制性内切酶，获得基因a和基因b发生无缝组装的融合基因。

在一个优选例中，步骤(6)之后，还包括：(7)将步骤(6)获得的基因a和基因b发生无缝组装的融合基因与其它1个或多个基因无缝组装的步骤(重复步骤(1)～(6)，以基因b替换基因a，以其它基因替换基因b)。

在另一优选例中，所述的red重组系统是同时含有能用不同诱导剂诱导表达red重组系统和i-scei酶的质粒；较佳地包括：帮助质粒ptkred。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的与基因b的5’端相同的序列片段1的长度至少为25bp，较佳地25～40bp。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的与基因b的5’端相同的序列片段2的长度至少为25bp；较佳地25～40bp。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的与基因b的5’端相同的序列片段3的长度至少为25bp；较佳地25～40bp。

在另一优选例中，所述的上游同源序列的长度至少为25bp；较佳地40～1000bp。

在另一优选例中，所述的下游同源序列的长度至少为25bp；较佳地40～1000bp。

在另一优选例中，所述的i-scei识别序列为：tagggataacagggtaat或其反向互补序列。

在另一优选例中，所述的teta的序列包括：启动子和teta基因序列。

在另一优选例中，所述的启动子的序列如seqidno:1。

在另一优选例中，所述的teta基因序列如seqidno:2所示。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞；较佳地，为大肠杆菌细胞或沙门氏菌细胞。

在另一优选例中，所述的基因a为crte，所述的基因b为crtb，所述的其它基因为crti。

在本发明的另一方面，提供一种用于进行dna无缝组装的试剂盒，所述试剂盒中包括：teta基因或含有teta基因序列的质粒；较佳地，所述的teta基因包括启动子；更佳地，所述的启动子的序列如seqidno:1所示。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：同时含有能用不同诱导剂诱导表达red重组系统和i-scei酶的质粒；较佳地包括：帮助质粒ptkred。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：四环素类抗生素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1a、本发明改造的质粒pjk58的图谱。

图1b、本发明改造的质粒pjk70的图谱。

图2、本发明的dna无缝组装的序列拼接的原理示意图。图中，teta区段包含了位于编码序列5’端的启动子序列(在teta启动子的5’端加上与基因b的5’端相同的序列片段2)。

图3、本发明的dna无缝组装实施过程的原理示意图。

图4、无缝组装(crte、crtb和crti组装)在细胞内完成之后，细胞在bma培养基上进行负筛的表型。

图5、dna无缝组装(crte、crtb和crti组装)后获得的组装部位序列(crte、crtb和crti组装)的测序结果，清楚显示出组装过程没有引入任何附加序列。

图6、把组装好的序列(crte、crtb和crti组装)克隆到载体pjk58上，转化到大肠杆菌中，使用阿拉伯糖诱导表达，检测番茄红素的表达情况，结果进一步表明组装是成功的。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种简便、易于操作的dna无缝连接方法。本发明的方法可以实现多个dna片段之间的无缝组装，或可以将多个dna片段无缝组装到染色体上。采用本发明的方法，可以把任意长度的dna片段整合到细胞(如e.coli)染色体上。

如本文所用，所述的“dna”、“基因”包括了“dna片段”、“基因片段”。

如本文所用，鉴于dna的互补特点，所述的“基因x的5’端相同的序列”，涵盖与基因x的5’端序列完全一致的序列，或经转录或扩增后与之完全一致的序列。

本发明的方法的具体原理如图2～图3所示。

根据图2，首先，通过扩增获得基因a的序列，其5’端加上其上游同源序列；在其3’端加上一段与基因b的5’端相同的序列片段；然后，扩增获得teta的序列，在其5’端加上(5’→3’)i-scei识别序列及基因b的5’端序列片段；在其3’端加上(5’→3’)i-scei识别序列与基因b的5’端相同的序列片段；第三，扩增获得基因b的序列，其3’端加上其下游同源序列；第四，将前述步骤(1)～(3)获得的扩增产物混合作为模板，进行pcr获得“基因a-teta-基因b”序列。

根据图3，首先诱导表达red重组系统，对前述获得的“基因a-teta-基因b”序列整合到宿主染色体上，使用teta正向选择，获得阳性克隆并测序确认。随后同时诱导表达red重组系统和i-scei限制性内切酶，i-scei酶识别酶切位点并对序列进行剪切，再藉由red重组系统进行同源重组，使用teta负筛方法获得基因a和基因b发生无缝组装的宿主细胞并测序验证，从而获得基因a和基因b发生无缝组装的融合基因。

如上方法，可以实现基因a与基因b的无缝组装。

本发明中，以teta基因作为实现基因a与基因b无缝连接的中间基因。teta基因编码一种跨膜泵蛋白，能从细胞内将四环素类抗生素排出。作为本发明的优选方式，本发明人通过优化比较，对teta使用了高效启动子序列，teta序列也进行了优化选择，使得负筛效率可以达到100％。因此，作为本发明的优选方式，应用seqidno:1所示的序列作为驱动teta基因表达的启动子，应用seqidno:2所示的序列作为teta基因编码序列。

本发明中，使用red重组系统进行序列重组。red同源重组技术是一项可在染色体水平上进行遗传操作技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程。

本发明中，使用i-scei限制性内切酶进行序列剪切。i-scei识别位点含有18个碱基，所以在染色体上含有此识别位点的概率非常低，这保证了该方法能够用于基因序列在染色体上无缝组装。

本发明方法，只需要一个帮助质粒，一次转化，通过使用teta负筛来找到最终的阳性克隆。

基于本发明的新方法，本发明还提供了一种用于进行dna无缝组装的试剂盒，所述试剂盒中包括在本发明的方法中所应用的部分或全部的试剂。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中包括选自以下的试剂：teta基因或含有teta基因序列的质粒，所述的teta基因包括启动子和tetadna序列；ptkred质粒，四环素类抗生素。

所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中描述了本发明的进行dna无缝组装的方法，以便于本领域技术人员应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

菌种

采用大肠杆菌e.colik-12mg1655。

质粒

采用ptkred(购买自addgene)、pjk58(本实验室构建)、pjk70(本实验室构建)和pucteta(本实验室构建)。

pjk58的构建方法：bla基因通过pcr从puc18质粒上克隆得到，前向引物包含了t4-g32终止子序列，pucori复制子从puc18质粒上pcr克隆得到，随后进行overlappcr，使得前面得到的两段序列融合成一条序列。arac基因序列及阿拉伯糖诱导型启动子序列pbad从ptkred载体上pcr克隆获得，然后对得到的两条序列进行酶切连接，构建成质粒pjk58(见图1a)。

pjk70：以pjk58为基础，采用ibrick的方法，把crte、crtb和crti组装到pjk58上形成了pjk70(见图1b)。

pucteta：在puc18上连接teta基因及所需的启动子序列，连接入hindiii和ecori之间，形成了新的质粒pucteta。

lb培养基(/l)

蛋白质(tryptone)：10g；

酵母菌(yeastextract)：5g；

nacl：10g；

调节ph值到7.0，然后121℃湿热灭菌。

bma培养基配方：

瓶a：agar12g；蛋白胨4g；酵母抽提物4g；加ddh2o到400ml；

瓶b：nacl8g；nah2po48g；加ddh2o到400ml。

各自灭菌20分钟，冷却到适当温度后，在瓶a中加入500μlfusaricacid(即9.6mgfusaricacid溶于dimethylformamide)，在瓶b中加入4ml20mmzncl2。然后混合瓶a和瓶b。混合好之后开始倒平板，避光，在36小时内使用这些平板。

pcr试剂使用全式金的fastpfudna聚合酶及配套的试剂。

实施例1、拼接crte、crtb和crti三个基因的引物及方法设计

本实施例中，以无缝拼接crte、crtb和crti三个基因为例。以teta基因负筛技术来选择阳性克隆。先以crte作为基因a，crtb作为基因b。

本实施例中，所涉及的各个基因的dna序列如下：

(1)teta基因使用的启动子序列(seqidno:1)：

atcgttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagctactagagaaagaggagaaatactag

(2)teta基因序列(seqidno:2)：

atgaatagttcgacaaagatcgcattggtaattacgttactcgatgccatggggattggccttatcatgccagtcttgccaacgttattacgtgaatttattgcttcggaagatatcgctaaccactttggcgtattgcttgcactttatgcgttaatgcaggttatctttgctccttggcttggaaaaatgtctgaccgatttggtcggcgcccagtgctgttgttgtcattaataggcgcatcgctggattacttattgctggctttttcaagtgcgctttggatgctgtatttaggccgtttgctttcagggatcacaggagctactggggctgtcgcggcatcggtcattgccgataccacctcagcttctcaacgcgtgaagtggttcggttggttaggggcaagttttgggcttggtttaatagcggggcctattattggtggttttgcaggagagatttcaccgcatagtcccttttttatcgctgcgttgctaaatattgtcactttccttgtggttatgttttggttccgtgaaaccaaaaatacacgtgataatacagataccgaagtaggggttgagacgcaatcaaattcggtgtacatcactttatttaaaacgatgcccattttgttgattatttatttttcagcgcaattgataggccaaattcccgcaacggtgtgggtgctatttaccgaaaatcgttttggatggaatagcatgatggttggcttttcattagcgggtcttggtcttttacactcagtattccaagcctttgtggcaggaagaatagccactaaatggggcgaaaaaacggcagtactgctcggatttattgcagatagtagtgcatttgcctttttagcgtttatatctgaaggttggttagttttccctgttttaattttattggctggtggtgggatcgctttacctgcattacagggagtgatgtctatccaaacaaagagtcatcagcaaggtgctttacagggattattggtgagccttaccaatgcaaccggtgttattggcccattactgtttgctgttatttataatcattcactaccaatttgggatggctggatttggattattggtttagcgttttactgtattattatcctgctatcaatgaccttcatgttgacccctcaagctcaggggagtaaacaggagacaagtgcttag(seqidno:2)

(3)crte基因序列(seqidno:3)

atgacggtctgcgcaaaaaaacacgttcatctcactcgcgatgctgcggagcagttactggctgatattgatcgacgccttgatcagttattgcccgtggagggagaacgggatgttgtgggtgccgcgatgcgtgaaggtgcgctggcaccgggaaaacgtattcgccccatgttgctgttgctgaccgcccgcgatctgggttgcgctgtcagccatgacggattactggatttggcctgtgcggtggaaatggtccacgcggcttcgctgatccttgacgatatgccctgcatggacgatgcgaagctgcggcgcggacgccctaccattcattctcattacggagagcatgtggcaatactggcggcggttgccttgctgagtaaagcctttggcgtaattgccgatgcagatggcctcacgccgctggcaaaaaatcgggcggtttctgaactgtcaaacgccatcggcatgcaaggattggttcagggtcagttcaaggatctgtctgaaggggataagccgcgcagcgctgaagctattttgatgacgaatcactttaaaaccagcacgctgttttgtgcctccatgcagatggcctcgattgttgcgaatgcctccagcgaagcgcgtgattgcctgcatcgtttttcacttgatcttggtcaggcatttcaactgctggacgatttgaccgatggcatgaccgacaccggtaaggatagcaatcaggacgccggtaaatcgacgctggtcaatctgttaggcccgagggcggttgaagaacgtctgagacaacatcttcagcttgccagtgagcatctctctgcggcctgccaacacgggcacgccactcaacattttattcaggcctggtttgacaaaaaactcgctgccgtcagttaa

(4)crtb基因序列(seqidno:4)

atgaataatccgtcgttactcaatcatgcggtcgaaacgatggcagttggctcgaaaagttttgcgacagcctcaaagttatttgatgcaaaaacccggcgcagcgtactgatgctctacgcctggtgccgccattgtgacgatgttattgacgatcagacgctgggctttcaggcccggcagcctgccttacaaacgcccgaacaacgtctgatgcaacttgagatgaaaacgcgccaggcctatgcaggatcgcagatgcacgaaccggcgtttgcggcttttcaggaagtggctatggctcatgatatcgccccggcttacgcgtttgatcatctggaaggcttcgccatggatgtacgcgaagcgcaatacagccaactggatgatacgctgcgctattgctatcacgttgcaggcgttgtcggcttgatgatggcgcaaatcatgggcgtgcgggataacgccacgctggaccgcgcctgtgaccttgggctggcatttcagttgaccaatattgctcgcgatattgtggacgatgcgcatgcgggccgctgttatctgccggcaagctggctggagcatgaaggtctgaacaaagagaattatgcggcacctgaaaaccgtcaggcgctgagccgtatcgcccgtcgtttggtgcaggaagcagaaccttactatttgtctgccacagccggcctggcagggttgcccctgcgttccgcctgggcaatcgctacggcgaagcaggtttaccggaaaataggtgtcaaagttgaacaggccggtcagcaagcctgggatcagcggcagtcaacgaccacgcccgaaaaattaacgctgctgctggccgcctctggtcaggcccttacttcccggatgcgggctcatcctccccgccctgcgcatctctggcagcgcccgctctag

(5)crti基因序列(seqidno:5)

atgaaaccaactacggtaattggtgcaggcttcggtggcctggcactggcaattcgtctacaagctgcggggatccccgtcttactgcttgaacaacgtgataaacccggcggtcgggcttatgtctacgaggatcaggggtttacctttgatgcaggcccgacggttatcaccgatcccagtgccattgaagaactgtttgcactggcaggaaaacagttaaaagagtatgtcgaactgctgccggttacgccgttttaccgcctgtgttgggagtcagggaaggtctttaattacgataacgatcaaacccggctcgaagcgcagattcagcagtttaatccccgcgatgtcgaaggttatcgtcagtttctggactattcacgcgcggtgtttaaagaaggctatctaaagctcggtactgtcccttttttatcgttcagagacatgcttcgcgccgcacctcaactggcgaaactgcaagcatggagaagcgtttacagtaaggttgccagttacatcgaagatgaacatctgcgccaggcgttttctttccactcgctgttggtgggcggcaatcccttcgccacctcatccatttatacgttgatacacgcgctggagcgtgagtggggcgtctggtttccgcgtggcggcaccggcgcattagttcaggggatgataaagctgtttcaggatctgggtggcgaagtcgtgttaaacgccagagtcagccatatggaaacgacaggaaacaagattgaagccgtgcatttagaggacggtcgcaggttcctgacgcaagccgtcgcgtcaaatgcagatgtggttcatacctatcgcgacctgttaagccagcaccctgccgcggttaagcagtccaacaaactgcaaactaagcgcatgagtaactctctgtttgtgctctattttggtttgaatcaccatcatgatcagctcgcgcatcacacggtttgtttcggcccgcgttaccgcgagctgattgacgaaatttttaatcatgatggcctcgcagaggacttctcactttatctgcacgcgccctgtgtcacggattcgtcactggcgcctgaaggttgcggcagttactatgtgttggcgccggtgccgcatttaggcaccgcgaacctcgactggacggttgaggggccaaaactacgcgaccgtatttttgcgtaccttgagcagcattacatgcctggcttacggagtcagctggtcacgcaccggatgtttacgccgtttgattttcgcgaccagcttaatgcctatcatggctcagccttttctgtggagcccgttcttacccagagcgcctggtttcggccgcataaccgcgataaaaccattactaatctctacctggtcggcgcaggcacgcatcccggcgcaggcattcctggcgtcatcggctcggcaaaagcgacagcaggtttgatgctggaggatctgatatga

本实施例中所使用的引物如下：

(1)第一轮中，用于连接crte与crtb的引物

用于扩增上游同源序列的引物(该引物扩增后，可以在crte的加上上游同源序列)：

crte-h-f1：tgtcggcgtgtagtagtgaacctgttc(seqidno:6)；

crte-h-r1：gcagaccgtcatctagtatttctcctcttttcttgccgctcc

cctgcatt(seqidno:7)。

用于扩增crte的引物(该引物扩增后，可以在crte的3’端加上一段crtb的5’端相同的序列片段)：

crte-f：aatgcaggggagcggcaagaaaagaggagaaatactagatga

cggtctgcg(seqidno:8)；

crte-r1：acgacggattattcatctagtatttctcctctttttaactgacg

gcagcgagttttttgt(seqidno:9)；

crte-r2：gttatccctaaccgcatgattgagtaacgacggattattca

tctagtatttctcctcttt(seqidno:10)；在crte-r1和crte-r2中下划线标示的序列用于在crte的3’端加上一段crtb的5’端相同的序列片段。

用于扩增teta及其启动子的引物(第一轮)(该引物扩增后，可以在teta的两端加上i-scei识别序列及crtb的5’端序列片段)：

teta-f1：atgaataatccgtcgttactcaatcatgcggttagggataaca

gggtaatatcgttg(seqidno:11)；其中，曲线下划线标示序列为crtb编码区的1-32区间，直线下划线标示序列为i-scei识别序列。

teta-r1：attattcatctagtatttctcctctttattaccctgttatccc

tactaagcacttgtctc(seqidno:12)；其中，直线下划线标示序列为crtb的1-9区间的反向互补序列，曲线双下划线标示序列为i-scei识别序列。

用于扩增crtb的引物：

crtb-f1：ataacagggtaataaagaggagaaatactagatgaataat

ccgtcgttactcaatcatgc(seqidno:13)；

crtb-r1：cttaaatgtgattcaacatcactggagaaagtcttctagag

cgggcgctgccag(seqidno:14)；其中，下划线部分用于在crtb序列的3’端加上其下游同源序列。

用于扩增下游同源序列的引物：

crtb-h-f1：tctggcagcgcccgctctagaagactttctccagtgatgt

tgaatcacattt(seqidno:15)；

crtb-h-r1：caatttcgccagacaagcagaatcaag(seqidno:16)。

(2)第二轮，用于将crti连接到crte-crtb所需的引物

第二轮用于扩增上游同源序列的引物：

teta-h-f：ctatgcaggatcgcagatgcacgaa(seqidno:17)；

teta-h-r1：accgtagttggtttcatctagtatttctcctctttctagagcgggcgctgccagag(seqidno:18)；

teta-h-r2：gccaccgaagcctgcaccaattaccgtagttggtttcatctagtatttctcctcttt(seqidno:19)；

teta-h-r3：gtcaacgatattaccctgttatccctagccaccgaagcctgcaccaatt(seqidno:20)；

用于扩增teta的引物(第二轮)：

teta-f2：aattggtgcaggcttcggtggctagggataacagggtaatatcgttgacgg(seqidno:21)；

teta-r2：attaccctgttatccctactaagcacttgtctc(seqidno:22)。

用于扩增crti序列：

crti-f1：gataacagggtaataaagaggagaaatactagatgaaaccaactacggtaattggtgcag(seqidno:23)；

crti-f2：aaacaggagacaagtgcttagtagggataacagggtaataaagaggagaaatactagatg(seqidno:24)；

crti-r1：gtgattcaacatcactggagaaagtctttcatatcagatcctccagcatcaaacct(seqidno:25)；

用于扩增下游同源序列(第二轮)：

crti-h-f1：aggtttgatgctggaggatctgatatgaaagactttctccagtgatgttgaatcacattt(seqidno:26)；

反向引物使用crtb-h-r1。

(3)克隆到载体的引物

组装好的crte、crtb和crti基因克隆到载体pjk58所用的引物：

crtebi-f1：taccttggcaaacagctattatgggtattatgggtaaagaggagaaatactagatgacggtctgc(seqidno:27)；

crtebi-r1：taggatacccataatacccataatagctgtttgccatcata

tcagatcctccagcatcaaacct(seqidno:28)。

实施例2、dna片段制备

根据图2所示，首先进行pcr，扩增得到所需要的dna序列。pcr共分为两轮。

1、第一轮

(1)、获得crte序列及其上游同源序列的融合序列

以e.coli染色体为模板，使用引物crte-h-f1和crte-h-r1扩增出crte的上游同源序列；

以pjk70为模板，使用crte-f和crte-r1、crte-r2扩增得到crte序列；

然后，通过overlap-pcr的方法，把crte序列及其上游同源序列融合在一起。

(2)、获得teta基因序列

以pucteta为模板，使用teta-f1和teta-r1扩增出teta基因。

(3)、获得crtb与其下游同源序列的融合序列

以pjk70为模板，使用crtb-f1和crtb-r1扩增出crtb序列；

以e.coli染色体为模板，使用crtb-h-f1和crtb-h-r1扩增出crtb下游同源序列；

然后，通过overlap-pcr的方法，把crtb与其下游同源序列融合在一起。

(4)、进一步融合

使用前述获得的三个pcr产物适当比例混合在一起作为模板，以crte-h-f1和crtb-h-r1分别作为前向和反向引物，采用touchdownpcr方法，将前面获得的三个pcr产物融合在一起，形成“上游同源序列+crte+teta+crtb+下游同源序列”dna序列片段。

2、第二轮

采用实施例1所列的第二轮的引物，在第一轮经过转化诱导组装筛选之后的基础上进行pcr，采用与前述类似的方法，形成“上游同源序列+teta+crti+下游同源序列”，以便进行第二轮的转化诱导组装筛选。

实施例2、转化

根据图3进行，首先将质粒ptkred转化入e.colik-12，然后使用iptg(终浓度1mm)诱导red重组系统表达。之后，制作电转化感受态，将实施例1第1轮制备的dna片段电转入，在含有四环素(终浓度10μg/ml)的平板上筛选阳性克隆，测序确定dna片段是否准确整合到e.coli染色体上设定位点。

对于正确的克隆，过夜培养，同时加入iptg(终浓度1mm)和阿拉伯糖(终浓度0.2％)诱导red重组系统和i-scei酶表达，随后取适量培养基，梯度稀释，在bma平板上进行负筛，对于长出来的克隆进行测序验证，确定crte和crtb基因无缝组装成功。

随后，使用测序正确的菌株作为宿主，使用第二轮pcr产生的dna片段，依照上述类似的方法，进行第二轮的转化诱导筛选测序验证，确定crti与crte-crtb无缝组装成功。

由于本发明人使用了优化选择的启动子和teta基因序列，在bma培养基上负筛的效率能够达到100％。负筛表型见图4。测序结果见图5。

上述结果说明，本发明的方法进行dna无缝组装是可行的，而且筛选效率是高的。

实施例3、诱导进一步验证

由于本发明人使用了crte、crtb和crti组装作为实例，这三个基因表达可以产生番茄红素，本发明人把组装好的序列克隆到载体pjk58上，转化到大肠杆菌中，使用阿拉伯糖诱导表达。

结果如图6所示，可以看到番茄红素得到了表达。

进一步地，本发明人对菌体进行裂解，并用乙酸乙酯进行抽提，进行lc-ms表征，结果显示产生番茄红素。这说明本发明人的组装方法是正确的，可以推广用的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>华东理工大学

<120>体内dna无缝组装方法

<130>174587

<160>28

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>65

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>teta基因启动子

<400>1

atcgttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagctactagagaaagaggagaaat60

actag65

<210>2

<211>1206

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>teta基因序列

<400>2

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<223>crte基因序列

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<223>crti基因序列

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acct64