本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种菠萝蛋白酶稳定剂及其制备方法和应用。
背景技术
菠萝蛋白酶(bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(ananacomosus)植株中的蛋白质水解酶，是从菠萝果茎或皮提取出来，经精制、提纯、浓缩和冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。菠萝蛋白酶为浅黄色无定形粉末，分子量约为3300，等电点为9.55，ph在6.5-7.5之间，最适ph为7.1，不完全溶于水，也不溶于乙醇、氯仿和丙酮等有机溶剂。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，含有2.1％的糖成分，有4个n-乙酰化的氨基己糖，是由疏基蛋白质和非蛋白酶组成的复杂复合物，也是一种巯基蛋白水解酶，属于混合物。菠萝蛋白酶作为单一肽链而存在，在菠萝蛋白酶分子中，对其催化活性起关键作用的必需基团是疏基、氨基、色氨酸残基及组氨酸残基。因菠萝蛋白酶含有一个不稳定的游离疏基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化，形成一种可自行降解的醌—硫醇复合物，从而导致酶失去活性。酶分子的三维构象在一些外力的作用下会发生变化，如氢键、范德华力、共价二硫键、疏水相互作用和静电相互作用等，其它因素如温度、ph、金属离子、加工助剂或激活剂等会导致酶活下降。
菠萝蛋白酶作为一种酶制剂，在工业生产过程中不可避免的需要在一定条件进行长时间加工、运输和储存这样一个流通环节。而在常温状态下，作为一种生物催化剂，菠萝蛋白酶在加工、生产、运输和储存等过程中极易受到环境因素变化和微生物污染的影响；而且如环境因素温度、压力、ph和离子强度等的变化会引起酶蛋白的变性失活；此外微生物的快速增长，则会快速的导致酶蛋白被生物降解而失活。因此，提高菠萝蛋白酶的稳定性，减少生产过程中的酶活损失，尽可能的保持酶在运输、储存过程中的稳定性是提高其在工业化生产和工业化应用的关键点。
目前针对酶制剂产品提高酶的热稳定性、延长酶的储藏寿命方面的研究，主要有四个方面：(1)嗜热有机体中酶的研究；(2)蛋白质变性的研究；(3)蛋白质分子的化学修饰；(4)添加保护剂对酶的保护作用。而关于提高菠萝蛋白酶稳定剂性的方法有：(1)添加有关食品添加剂，通过对酶活性中心的保护作用，减少酶活性中心的氧化，提高酶活稳定性；(2)通过对菠萝蛋白酶进行化学修饰提高菠萝蛋白酶稳定性；(3)通过对菠萝蛋白酶进行固定化生成固定化酶，改变其耐热范围等来提高菠萝蛋白酶稳定性。其中最常用的是通过加入保护剂的方式对酶进行保护。目前市场上对于菠萝蛋白酶保护剂的研究，主要是根据菠萝蛋白酶所具有的自身特性，结合生产，通过添加盐类、多糖类或多元醇类等来提高菠萝蛋白酶酶活的稳定性，增加工业生产价值。采用多糖类或多元醇等作为保护剂一般使用量较大，对于菠萝酶浸膏或者液体菠萝蛋白酶溶液而言，其添加量更大，对于单个的盐类保护剂虽然也可以在较小的剂量下起到一定保护作用，但是对于酶活的保护效果不明显，放置后酶活损失依然较快，特别是在固体粉末状菠萝蛋白酶保存中。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种菠萝蛋白酶稳定剂，该菠萝蛋白酶稳定剂具有保护酶活效果明显、减少酶活损失和延长酶的半衰期等优点；而且各个组分价格便宜、组分简单、方便易得、使用量少和使用方便、成本较低和方便推广应用；此外，菠萝蛋白酶稳定剂可直接添加用于酶固体粉末保存或液体酶生产过程中，应用范围广泛。
本发明的第二目的在于提供一种菠萝蛋白酶稳定剂的制备方法，将配方量的各组分混合均匀后得到菠萝蛋白酶稳定剂，该制备方法操作简单，便于工业化生产。
本发明的第三目的在于提供菠萝蛋白酶稳定剂在减少菠萝蛋白酶酶活损失中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括如下组分：还原剂0.015-0.13份、金属离子螯合剂0.002-0.07份、有机羧酸盐0.01-0.09份、防腐剂0.05-0.15份和维生素0.001-0.02份。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，菠萝蛋白酶稳定剂按重量份数计包括如下组分：还原剂0.045-0.1份、金属离子螯合剂0.005-0.04份、有机羧酸盐0.02-0.08份、防腐剂0.06-0.13份和维生素0.001-0.01份。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，菠萝蛋白酶稳定剂按重量份数计包括如下组分：还原剂0.075-0.0.09份、金属离子螯合剂0.008-0.01份、有机羧酸盐0.03-0.05份、防腐剂0.08-0.12份和维生素0.002-0.005份。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，还原剂包括d-异抗坏血酸钠、l-半胱氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠或β-疏基乙醇中的至少一种，优选d-异抗坏血酸钠和l-半胱氨酸。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，金属离子螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸或多聚磷酸钠中的至少一种，优选乙二胺四乙酸二钠。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，有机羧酸盐包括乙酸钠、草酸钠、酒石酸钾钠或柠檬酸钠中的至少一种，优选乙酸钠。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，防腐剂包括山梨酸钾、苯甲酸钠或乙酸钙中的至少一种，优选山梨酸钾。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，维生素包括维生素b、维生素c或维生素e中的至少一种，优选维生素b，进一步优选维生素b9。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，菠萝蛋白酶稳定剂按重量份数计包括如下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙二胺四乙酸二钠0.01份、乙酸钠0.04份、山梨酸钾0.1份和维生素b90.002份。
第二方面，本发明提供了一种菠萝蛋白酶稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
将配方量的还原剂、金属离子螯合剂、有机羧酸盐、防腐剂和维生素混合均匀后得到菠萝蛋白酶稳定剂。
第三方面，本发明提供了菠萝蛋白酶稳定剂在减少菠萝蛋白酶酶活损失中的应用；
优选地，所述应用包括以下步骤：按固体酶粉末的1.5-3wt％添加菠萝蛋白酶稳定剂；或，按液体酶的0.1-0.3wt％添加菠萝蛋白酶稳定剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的菠萝蛋白酶稳定剂，其中，还原剂通过抗氧化的作用，可以有效阻止菠萝蛋白酶的游离疏基氧化，防止酶失活；金属离子螯合剂能与多价金属离子形成可溶性金属络合物，减少金属离子对酶活的影响；有机羧酸盐可以影响溶剂结构和疏水相互作用，维护酶分子的活性三维构象，明显延长菠萝蛋白酶的半衰期；防腐剂可以有效减少污染微生物的生长，大大减少酶蛋白被生物降解而失活，延长酶保持活性的时间；维生素竞争性参与菠萝酶溶液中氧分子的消耗，减少了菠萝蛋白酶活性中心被氧化的机会，间接的起到保护菠萝蛋白酶活性中心。
通过上述各个组分和组分含量的合理配比，使菠萝蛋白酶稳定剂具有保护酶活效果明显、减少酶活损失和延长酶的半衰期等优点；菠萝蛋白酶稳定剂的各个组分价格便宜、组分简单、方便易得、使用量少和使用方便，使菠萝蛋白酶稳定剂成本较低，方便推广应用；此外，菠萝蛋白酶稳定剂可直接添加用于酶固体粉末保存或液体酶生产过程中，应用范围广泛。
(2)本发明提供的菠萝蛋白酶稳定剂的制备方法，将配方量的各组分混合均匀后得到菠萝蛋白酶稳定剂，该制备方法操作简单，便于工业化生产。
(3)本发明提供的菠萝蛋白酶稳定剂在55℃的条件下，将菠萝蛋白酶的半衰期延长一倍以上，保护效果明显。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的第一个方面，提供了一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括如下组分：还原剂0.015-0.13份、金属离子螯合剂0.002-0.07份、有机羧酸盐0.01-0.09份、防腐剂0.05-0.15份和维生素0.001-0.02份。
还原剂通过抗氧化的作用，可以有效阻止菠萝蛋白酶的游离疏基氧化，防止酶失活。还原剂典型但非限制性的含量例如为0.015重量份、0.045重量份、0.075重量份、0.09重量份、0.1重量份或0.13重量份。
金属离子螯合剂能与多价金属离子形成可溶性金属络合物，减少金属离子对酶活的影响。金属离子螯合剂典型但非限制性的含量例如为0.002重量份、0.005重量份、0.008重量份、0.01重量份、0.04重量份或0.07重量份。
有机羧酸盐可以影响溶剂结构和疏水相互作用，维护酶分子的活性三维构象，明显延长菠萝蛋白酶的半衰期。有机羧酸盐典型但非限制性的含量例如为0.01重量份、0.03重量份、0.05重量份、0.07重量份或0.09重量份。
防腐剂可以有效减少污染微生物的生长，大大减少酶蛋白被生物降解而失活，延长酶保持活性的时间。防腐剂典型但非限制性的含量例如为0.05重量份、0.07重量份、0.09重量份、0.12重量份、0.13重量份或0.15重量份。
维生素竞争性参与菠萝酶溶液中氧分子的消耗，减少了菠萝蛋白酶活性中心被氧化的机会，间接的起到保护菠萝蛋白酶活性中心的作用。维生素典型但非限制性的含量例如为0.001重量份、0.004重量份、0.008重量份、0.01重量份、0.015重量份、0.018重量份或0.02重量份。
通过上述各个组分和组分含量的合理配比，使菠萝蛋白酶稳定剂具有保护酶活效果明显、减少酶活损失和延长酶的半衰期等优点；菠萝蛋白酶稳定剂的各个组分价格便宜、组分简单、方便易得、使用量少和使用方便，使菠萝蛋白酶稳定剂成本较低，方便推广应用；此外，菠萝蛋白酶稳定剂可直接添加用于酶固体粉末保存或液体酶生产过程中，应用范围广泛。
在一种优选的实施方式中，菠萝蛋白酶稳定剂按重量份数计包括如下组分：还原剂0.045-0.1份、金属离子螯合剂0.005-0.04份、有机羧酸盐0.02-0.08份、防腐剂0.06-0.13份和维生素0.001-0.01份。
在一种优选的实施方式中，菠萝蛋白酶稳定剂按重量份数计包括如下组分：还原剂0.075-0.0.09份、金属离子螯合剂0.008-0.01份、有机羧酸盐0.03-0.05份、防腐剂0.08-0.12份和维生素0.002-0.005份。
通过更进一步优化菠萝蛋白酶稳定剂中各组分的含量配比，可以使菠萝蛋白酶稳定剂保护酶活效果明显、减少酶活损失和延长酶的半衰期等优点更加突出，有利于其在酶固体粉末保存或液体酶生产过程中的推广应用。
在一种优选的实施方式中，还原剂包括d-异抗坏血酸钠、l-半胱氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠或β-疏基乙醇中的至少一种，优选d-异抗坏血酸钠和l-半胱氨酸。
菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其分子中的巯基是酶表现活性的必须基团之一，巯基易被氧化形成二硫键使酶活性受到抑制。加入还原剂后，依靠其抗氧化作用，可以有效阻止菠萝蛋白酶的游离疏基氧化，防止酶失活。
通过优选还原剂可以更好的发挥还原剂的抗氧化效果，优选d-异抗坏血酸钠和l-半胱氨酸联合使用，会进一步促进还原剂阻止菠萝蛋白酶的游离巯基氧化，更有效地减少酶活损失。
在一种优选的实施方式中，金属离子螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸或多聚磷酸钠中的至少一种，优选乙二胺四乙酸二钠。
在工厂规模生产中，由于机械设备和原辅材料等原因，不可避免菠萝蛋白酶受到金属离子的污染，如cu2+、fe2+、pb2+等对菠萝蛋白酶酶活有较强的抑制作用。而金属离子螯合剂可以从一定程度上降低金属离子对酶的影响。
通过优选金属离子螯合剂可以更有效减少金属离子对酶活的影响，最大限度的保持酶活。优选乙二胺四乙酸二钠为金属离子螯合剂，可以更好的发挥金属离子螯合剂的效果，增强菠萝蛋白酶减少酶活损失的效果。
在一种优选的实施方式中，有机羧酸盐包括乙酸钠、草酸钠、酒石酸钾钠或柠檬酸钠中的至少一种，优选乙酸钠。
疏水相互作用在维系菠萝蛋白酶分子三维构像中起重要作用，在水和水溶性有机物组成的混合溶剂中，疏水相互作用的大小取决于溶剂的结构，当混合溶剂中的水分子最大程度形成氢键时，可获得最大的疏水相互作用，多羟基化合物对酶分子稳定性的影响，就取决于这些物质对水分子结构的影响。
通过优选有机羧酸盐可以减少溶剂结构和疏水相互作用对酶分子的活性三维构象的影响，维护酶分子的活性三维构象，使菠萝蛋白酶稳定剂更好的发挥减少酶活损失的效果。
在一种优选的实施方式中，防腐剂包括山梨酸钾、苯甲酸钠或乙酸钙中的至少一种，优选山梨酸钾。
在菠萝蛋白酶提取、纯化和储存的过程中由于微生物酶的作用，特别是氧化脱氢酶，可以使菠萝蛋白酶发生氧化作用，使酶活性降低。加入防腐剂可以有效减少污染微生物的生长，降低微生物酶的作用，提高菠萝蛋白酶的活性。
通过优选菠萝蛋白酶稳定剂中的防腐剂可以使菠萝蛋白酶稳定剂发挥更好的效果，更有效地提高酶活性，延长酶保持活性的时间。
在一种优选的实施方式中，维生素包括维生素b、维生素c或维生素e中的至少一种，优选维生素b，进一步优选维生素b9。
优选维生素b9，也称叶酸，叶酸可以竞争性参与菠萝酶溶液中氧分子的消耗，减少菠萝蛋白酶活性中心被氧化的机会，间接的起到保护菠萝蛋白酶活性中心的作用。通过优选菠萝蛋白酶中添加的维生素种类，可以使菠萝蛋白酶更好的发挥减少酶活损失的效果，保持菠萝蛋白的活性。
在一种优选的实施方式中，一种典型的菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括如下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙二胺四乙酸二钠0.01份、乙酸钠0.04份、山梨酸钾0.1份和叶酸(维生素b9)0.002份。
通过优选菠萝蛋白酶稳定剂中的组分和组分含量，可使菠萝蛋白酶稳定剂更好地发挥减少酶活损失的效果，提高菠萝蛋白酶的活性。
根据本发明的第二个方面，提供了一种菠萝蛋白酶稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
将配方量的还原剂、金属离子螯合剂、有机羧酸盐、防腐剂和维生素混合均匀后得到菠萝蛋白酶稳定剂。
将配方量的各组分混合均匀后得到菠萝蛋白酶稳定剂，该制备方法操作简单，便于工业化生产。
根据本发明的第三个方面，提供了菠萝蛋白酶稳定剂在减少菠萝蛋白酶酶活损失中的应用；
优选地，所述应用包括以下步骤：按固体酶粉末的1.5-3wt％添加菠萝蛋白酶稳定剂；或，按液体酶的0.1-0.3wt％添加菠萝蛋白酶稳定剂。
在菠萝蛋白酶成品粉末中按比例添加菠萝蛋白酶稳定剂，在20℃常温状态下，菠萝蛋白酶固体粉末储存1年，酶活保留率提高96.5％。在液体菠萝酶生产过程中使用此保护剂，与不用保护剂的菠萝蛋白酶生产过程相比，其酶活可提高122.48％，其保护效果明显。
需要说明的是，本发明提供的菠萝蛋白酶稳定剂可以按比例配制好后添加使用，也可以按照其中各个组分的含量依次添加使用；即可以混合添加，也可以单独添加，具体使用情况可以自行选择。
本发明提供的菠萝蛋白酶稳定剂可以应用于菠萝蛋白酶保护中，减少菠萝蛋白酶酶活损失，延长酶的半衰期。可以通过添加到固体酶粉末和液体酶生产工艺过程中，应用广泛。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明方法和效果做进一步详细的说明。本发明涉及的各原料均可通过商购获取。
实施例1
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.005份、l-半胱氨酸0.01份、乙二胺四乙酸二钠0.002份、乙酸钠0.01份、山梨酸钾0.05份和叶酸0.001份。
实施例2
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.04份、l-半胱氨酸0.09份、乙二胺四乙酸二钠0.07份、乙酸钠0.09份、山梨酸钾0.15份和叶酸0.02份。
实施例3
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.06份、l-半胱氨酸0.04份、乙二胺四乙酸二钠0.005份、乙酸钠0.02份、山梨酸钾0.13份和叶酸0.01份。
实施例4
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.02份、l-半胱氨酸0.06份、乙二胺四乙酸二钠0.008份、乙酸钠0.05份、山梨酸钾0.08份和叶酸0.003份。
实施例5
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙二胺四乙酸二钠0.01份、乙酸钠0.04份、山梨酸钾0.1份和叶酸0.002份。
实施例6
本实施例与实施例5的区别在于：用β-疏基乙醇替代d-异抗坏血酸钠。
实施例7
本实施例与实施例5的区别在于：用多聚磷酸钠替代乙二胺四乙酸二钠。
实施例8
本实施例与实施例5的区别在于：用柠檬酸钠替代乙酸钠。
实施例9
本实施例与实施例5的区别在于：用苯甲酸钠替代山梨酸钾。
实施例10
本实施例与实施例5的区别在于：用维生素e替代叶酸。
对比例1
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.001份、l-半胱氨酸0.15份、乙二胺四乙酸二钠0.001份、乙酸钠0.15份、山梨酸钾0.02份和叶酸0.05份。
实施例5相比，组分含量不同。
对比例2
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.15份、l-半胱氨酸0.001份、乙二胺四乙酸二钠0.1份、乙酸钠0.005份、山梨酸钾0.2份和叶酸0.0005份。
实施例5相比，组分含量不同。
对比例3
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：乙二胺四乙酸二钠0.01份、乙酸钠0.04份、山梨酸钾0.1份和叶酸0.002份。
与实施例5相比，缺少d-异抗坏血酸钠和l-半胱氨酸。
对比例4
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙酸钠0.04份、山梨酸钾0.1份和叶酸0.002份。
与实施例5相比，缺少乙二胺四乙酸二钠。
对比例5
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙二胺四乙酸二钠0.01份、山梨酸钾0.1份和叶酸0.002份。
与实施例5相比，缺少乙酸钠。
对比例6
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙二胺四乙酸二钠0.01份、乙酸钠0.04份和叶酸0.002份。
与实施例5相比，缺少山梨酸钾。
对比例7
一种菠萝蛋白酶稳定剂，按重量份数计包括以下组分：d-异抗坏血酸钠0.01份、l-半胱氨酸0.075份、乙二胺四乙酸二钠0.01份、乙酸钠0.04份和山梨酸钾0.1份。
与实施例5相比，缺少叶酸。
对比例8
一种菠萝蛋白酶稳定化保护剂，包含质量百分比如下的成分：溶血卵磷脂40％、蔗糖10％、糊精30％和脱脂奶粉20％。
对比例9
一种菠萝蛋白酶稳定化保护剂，包含质量百分比如下的成分：异麦芽酮糖醇3.3％、聚乙二醇6001.2％、可溶性淀粉2.5％、氯化钙2％和去离子水91％。
为进一步验证上述实施例和对比例的效果，特设以下实验例。
实验例1酶活测定
对实施例1-6和对比例1-9提供的菠萝蛋白稳定剂保持菠萝蛋白酶酶活的效果进行检测。
一、实验试剂
1、酶稀释液：
称取l-半胱氨酸盐酸盐(c3n7no2s·hcl·h2o＝157.63)5.27g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠(c10h14n2o8na2·2h2o)2.23g，加水200ml溶解，合并两液均匀，用0.1mol/l氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至ph＝5.5，加水稀释至1000ml。使用前尽可能新鲜配制，2～8℃储存不超过三天。
2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液：
称取磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)17.89g，加水溶解，并定容至1000ml，2～8℃储存。
3、三氯乙酸溶液：
称取三氯乙酸17.99g，加无水乙酸钠29.94g和冰乙酸18.9ml，加适量水溶解后，加水定容至1000ml，振摇均匀，密封保存下可使用1个月。
4、酪蛋白底物溶液(临用现配)：
称取经硅胶干燥器中干燥至恒重的酪蛋白2.5g，置烧杯中，加入0.05mol/l磷酸氢二钠溶液40ml。在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用1.0mol/l盐酸调至ph＝7.0，转移到50ml容量瓶中，加水至刻度。
5、酶液(500u/ml)
称取经菠萝蛋白酶0.5g置烧杯中，加入40ml蒸馏水溶解，搅拌，直至完全溶解，冷却后，转移到50ml容量瓶中，加水至刻度。
二、实验方法
1、酶活定义(u/g)
指在37℃温度，ph值7.0下，每分钟水解酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量。
2、标准曲线绘制
a:样品组
a.向2ml离心管中加入860μl磷酸钾缓冲液(20mm，ph＝7.0)；
b.再加入新鲜配置的菠萝蛋白酶液40μl(20u)，置于37℃水浴锅中保温10min；
c.加入100μl(5mg)提前保温的的酪蛋白底物，于37℃水浴中精确反应10min；
d.向离心管中加入1000μl三氯乙酸溶液，震荡摇匀；
e.在13000rpm下离心5min，取上清液400μl至96孔板，在酶标仪上(275nm，enterpoint)测定吸光值，以水为空白调零。
b:对照组
a.向2ml离心管中加入860μl磷酸钾缓冲液(200mm，ph＝7.0)；
b.再加入新鲜配置的菠萝蛋白酶液40μl(20u)，置于37℃水浴锅中保温10min；
c.向离心管中加入1000μl三氯乙酸溶液，于37℃水浴中反应10min；
d.加入100μl(5mg)提前保温的的酪蛋白底物，震荡摇匀；
e.在13000rpm下离心5min，取上清液400μl至96孔板，在酶标仪上(275nm，enterpoint)测定吸光值，以水为空白调零。
c:标准曲线
取0.02mg/l、0.04mg/l、0.06mg/l、0.08mg/l、0.10mg/l、0.12mg/l、0.16mg/l、0.18mg/l以及0.2mg/l酪氨酸标准溶液稀释液，用水溶液作参比，在波长275nm处测定溶液的吸光度，根据吸光度和对应的酪氨酸浓度绘制标准曲线。
3、酶活测定
将菠萝蛋白酶成品酶(100万u/g)配置成每ml溶液中含有500u的菠萝蛋白酶溶液，再将实施例1-6和对比例1-9提供的菠萝蛋白稳定剂按10wt％加入，置于55℃下加热，分别测定1h、4h和8h时间点的菠萝蛋白酶酶活，以不添加任何保护剂的菠萝蛋白酶溶液为对照，以液体初始酶活为基准，计算相对时间的剩余酶活。
三、实验结果
1、吸光度和对应的酪氨酸浓度标准曲线公式：y＝6.9254x-0.0046，r2＝0.9994。
2、实施例1-6和对比例1-9提供的菠萝蛋白稳定剂保持菠萝蛋白酶酶活的效果测定结果如表1所示：
表1
表1的实验结果表明：对照组(不添加任何酶稳定剂)随着加热时间的延长，菠萝蛋白酶酶活逐渐下降，在加热至8h时，酶活完全丧失。证明菠萝蛋白酶在该温度下不稳定，高温破坏了菠萝蛋白酶催化活性中心，其半衰期在2.5h左右。从实验组结果来看，随着加热时间的延长，菠萝蛋白酶酶活下降缓慢，证明菠萝蛋白酶稳定剂对菠萝蛋白酶活性中心进行了很好的保护。
实施例5是本发明的一个优选实施方式，实施例1-4与实施例5的区别是组分含量不同，但组分含量在本发明的保护范围之内；实施例6-10与实施例5的区别是组分不同，但组分也都在本发明的保护范围之内；实施例5的菠萝蛋白酶酶活测定结果比实施例1-4和实施例6-10的结果更好，证明了实施例5是一个较为优选的实施方式。
实施例1-7的三个时间测定的剩余酶活都高于对比例1-7；对比例1-2与实施例5相比，区别是组分含量不同，对比例1和2的组分含量不在本发明的保护范围之内；对比例3-7与实施例5相比，区别是组分不同，比实施例5少一或两种组分。这表明本发明提供的菠萝蛋白酶的各个组分和组分含量的合理配对菠萝蛋白酶稳定剂减少酶活损失的作用有重要影响。
实施例1-7的三个时间测定的剩余酶活都高于对比例8和对比例9，对比例8和9是现有专利中提供的菠萝蛋白酶稳定剂，这表明本发明提供的菠萝蛋白酶稳定剂保护菠萝蛋白酶酶活的效果优于对比例8和对比例9提供的菠萝蛋白酶稳定剂。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。