本发明属于核苷化合物合成领域，更具体地，本发明涉及一种新型核苷修饰物3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷的制备方法。
背景技术：
近年，随着基因组创药的发展，反义寡核苷酸药物被急速开发，究其原因在于其较传统药物来讲具有以下几点优势：1)特异性较强。一个15聚体的反义寡核苷酸含有30-45氢键，而低分子的传统药物(200-600u)与靶点一般只形成1-4个键；2)信息量较大。遗传信息从dna-rna-蛋白质，用互补寡核苷酸阻断某种蛋白的合成是很准确的；3)反义药物以核酸为靶点，与蛋白质作为靶点比较，更易合理设计新药物。由于作用于遗传信息传递的上游，所需药量较低，副作用可能较少。随着技术研究的推进，对反义药物的研究正兴盛起来。国内已有数家科研单位正在开展反义药物的研究，并已有若干反义寡核苷酸产品处在临床前试验阶段，相信国产反义药物有望在未来5～8年内上市并造福于国内广大患者。但是，目前反义药物的工业化合成工艺进行仍处于初级阶段，而实验室规模的工艺制备，无法满足工业化要求。因此，本领域迫切需要提供有效且无需特别设备，适合大规模工业化生产反义药物或其前期合成原料的技术。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种新型核苷修饰物3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷的制备方法。在本发明的第一方面，提供一种制备式i所示核苷修饰化合物的方法，所述的方法包括：(1)以2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷(化合物f)作为原料，与硅烷化试剂反应，选择性地将5’-oh进行硅烷化保护，获得中间体e；其中，r1为硅烷化保护基团；(2)将(1)的中间体e与乙酸酐(ac2o)于dmso中进行反应，单一性地修饰3’-oh基团，得到中间体d；(3)将(2)的中间体d与磺酰氯进行反应，单一性地修饰3’-o-ch2sch3基团，得到中间体c；(4)将(3)的中间体c与叠氮化试剂进行反应，单一性地修饰3’-o-ch2cl基团，得到叠氮基取代的中间体b；(5)将(4)的中间体b脱除保护基，从而得到目标化合物a；在一个优选例中，(1)中，所述的硅烷化试剂为r1-cl，选自：tms-cl，tbdms-cl，tbdps-cl或其组合，优选地为tbdms-cl；较佳地，2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷与r1-cl按照摩尔比为1∶1.0-3.0(较佳地为1∶1.2-2.0；最佳地为1∶1.5)；或将5’-oh进行硅烷化保护在溶剂1中进行，所述的溶剂1选自：吡啶，二氯甲烷/三乙胺，乙腈/三乙胺；优选地为吡啶；较佳地，按照重量体积比溶剂1的用量为2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷的5～10倍。在另一优选例中，(1)中，进行硅烷化保护后，还包括进行结晶处理的步骤以纯化所述的中间体e；较佳地，以乙酸乙酯/正庚烷作为溶剂进行结晶；更佳地，按照重量体积比，结晶溶剂用量为2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷重量的5～10倍。在另一优选例中，(1)中，2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷以溶剂1溶解后减压带水，之后在60℃，进一步加入溶剂1溶解，搅拌、降温至0±2℃，加入硅烷化试剂进行反应。在另一优选例中，(1)中，进行硅烷化保护后、结晶之前，还包括进一步处理及萃取的步骤；较佳地，该步骤包括：向反应体系中加入乙醇搅拌，之后加入nahco3，搅拌，之后减压浓缩，溶于乙酸乙酯后，以盐水萃取后去水相，有机相进行干燥和过滤，乙酸乙酯淋洗，之后减压浓缩干。在另一优选例中，(2)中，乙酸酐的用量为中间体e的5～10倍摩尔当量；或所述的中间体e与乙酸酐在溶剂2中反应，同时加入dmso，所述溶剂2为醋酸；较佳地，dmso的用量为中间体e的20～30倍摩尔当量；较佳地，按照重量体积比溶剂2的用量为中间体e的5～10倍。在另一优选例中，(2)中，进行反应后，还包括进行结晶处理的步骤，以纯化所述的中间体d；较佳地，以乙酸乙酯/正庚烷作为结晶的溶剂；更佳地，按照重量体积比，结晶溶剂用量为中间体e的5～10倍。在另一优选例中，(2)中，化合物e以dmso和acoh溶解，冷却、搅拌，加入乙酸酐，控制加入速度使得温度小于40℃；加完后在45±2℃搅拌，反应10～15小时。在另一优选例中，(2)中，反应后、结晶之前，还包括进一步处理及萃取的步骤；较佳地，该步骤包括：反应体系降温至20±5℃；以乙酸乙酯稀释后以氯化钠萃取，合并水相；以乙酸乙酯反萃取，合并有机相；干燥、过滤、淋洗固体；之后减压浓缩干。在另一优选例中，(3)中，中间体d和磺酰氯的摩尔比为1∶1.0-3.0(较佳地为1∶1.5-2.5；最佳地为1∶2.0)。在另一优选例中，中间体d与磺酰氯在溶剂3中反应，所述的溶剂3为二氯甲烷/环己烯；较佳地，二氯甲烷的用量为中间体d重量体积比的5～10倍，环己烯的用量为中间体d重量体积比的1～2倍。在另一优选例中，(3)中，中间体d先用溶剂3溶解，再加入环己烯，加完后降温至-5±5℃；以二氯甲烷稀释磺酰氯后加入反应体系，控制温度0℃以下；加完后在0±5℃下搅拌反应。在另一优选例中，(4)中，所述叠氮化试剂选自：叠氮化钠，叠氮化锂，tms-n3或其组合；优选叠氮化钠；较佳地，中间体c和叠氮化试剂的摩尔比为1∶3.0-10.0(较佳地为1∶4.0-6.0；最佳地为1∶5.0)。在另一优选例中，中间体c与叠氮化试剂在溶剂4中进行反应；较佳地，溶剂4选自：dmf，dmso，乙腈或其组合；优选dmf；较佳地，按照重量体积比，溶剂4的用量为中间体c的5～10倍。在另一优选例中，(4)中，进行反应后，还包括进行结晶处理的步骤，以纯化所述的中间体b；较佳地，以乙酸乙酯/正庚烷作为结晶的溶剂；更佳地，按照重量体积比，结晶溶剂用量为中间体c的5～10倍。在另一优选例中，(4)中，在(3)的反应产物中加入叠氮化试剂，于30±2℃搅拌反应2±1小时。在另一优选例中，(4)中，反应后、结晶之前，还包括进一步处理及萃取的步骤；较佳地，该步骤包括：反应体系以乙酸乙酯稀释，以氯化钠萃取，合并水相，以乙酸乙酯反萃取，合并有机相，进一步再以氯化钠萃取以及以乙酸乙酯反萃取，合并有机相；干燥；过滤；淋洗固体；之后减压浓缩干。在另一优选例中，(5)中，中间体b与碱性试剂进行反应以脱去保护基；较佳地，所述碱性试剂选自：氢氧化钠，氢氧化钾或其组合；更佳地，所述碱性试剂的用量为化合物b的5～10倍摩尔当量；或中间体b与碱性试剂在溶剂5中进行反应，所述溶剂5选自：水/甲醇，水/乙醇，水/thf；优选地为水/乙醇；较佳地，重量体积比溶剂5的用量为化合物b的5～10倍，其中有机溶剂占比为50～90％。在另一优选例中，(5)中，进行反应后，还包括进行结晶处理的步骤，以纯化所述的化合物a；较佳地，进行结晶的溶剂选自：乙醇，甲醇，乙腈或其组合；优选乙醇；更佳地，按照重量体积比，结晶溶剂用量为化合物b的8～10倍。在另一优选例中，(5)中，将化合物b加入乙醇和水中搅拌溶解，降温至20±5℃，加入碱性试剂，在25±2℃搅拌反应。在另一优选例中，(5)中，反应后、结晶之前，还包括进一步后处理的步骤；较佳地，该步骤包括：将反应体系调节ph为7～8，于45±2℃减压浓缩；以水复溶；脱盐；减压浓缩。在本发明的另一方面，提供一种化合物，其结构式如式a所示：在一个优选例中，所述的化合物由所述方法制备获得。在本发明的另一方面，提供所述的化合物的用途，用于合成反义寡核苷酸。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。具体实施方式发明人经过广泛的研究和试验，首次发现使用现有的天然核苷修饰物2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷作为起始原料，经由一系列的反应，可以简便、经济地大量合成新型核苷修饰物3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷。本发明的方法无需特别设备，适合于大规模工业化生产。本发明的方法中，以2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷为原料，首先，将之与硅烷化试剂反应，选择性地将5’-oh进行硅烷化保护；接着，以乙酸酐与反应理，得到中间体3’-o-ch2sch3-2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷；然后，用磺酰氯处理该中间体，从而得到关键中间体3’-o-ch2cl-2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷；接着经过叠氮化取代、脱保护等工艺处理，高收率、高选择性地生成新型核苷修饰物3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷(化合物a)。本发明中，所述的3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷的结构如下式a：首先，本发明提供了一种式b所示的中间体化合物的制备方法，该化合物具有如下式b所示的结构式：所述的式b化合物可通过如下合成路线制备获得：更进一步地，本发明提供了一种适合工业化生产制备3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷(式a化合物)的方法，合成路线如下：作为本发明的优选方式，所述的硅烷化试剂为r1-cl，选自：tms-cl，tbdms-cl，tbdps-cl或其组合，优选地为tbdms-cl。作为本发明的优选方式，所述化合物f和硅烷化试剂r1-cl的摩尔比为1∶1.0-3.0；较佳地为1∶1.2-2.0；最佳地为1∶1.5。作为本发明的优选方式，乙酸酐的用量为中间体e的5～10倍摩尔当量。作为本发明的优选方式，所述中间体d和磺酰氯的摩尔比为1∶1.0-3.0；较佳地为1∶1.5-2.5；最佳地为1∶2.0。作为本发明的优选方式，所述中间体c和叠氮化试剂的摩尔比为1∶3.0-10.0；较佳地为1∶4.0-6.0；最佳地为1∶5.0。本发明涉及的各步骤的合成反应中，还包括应用各种溶剂来溶解各组分。作为本发明的优选方式，所所述的溶剂1选自：吡啶，二氯甲烷/三乙胺，乙腈/三乙胺；r1-cl试剂选自：tms-cl；tbdms-cl，tbdps-cl；应理解，溶剂1以及r1-cl试剂可以应用本领域技术人员熟悉的那些，只要能够实现溶解反应物且缚酸作用，同时不与r1-cl起反应的溶剂均是可以用于本发明中的。作为本发明的优选方式，所述的溶剂1试剂吡啶，r1-cl为tbdms-cl；结晶溶剂体系为：乙酸乙酯/正庚烷。作为本发明的优选方式，所所述的溶剂2为醋酸。更优选地，反应温度为40～45℃。作为本发明的优选方式，所述的溶剂3为二氯甲烷/环己烯。更优选地，反应温度为-5～5℃；作为本发明的优选方式，所述的溶剂4选自：dmf，dmso，乙腈；优选dmf；叠氮化试剂选自：叠氮化钠，叠氮化锂，tms-n3；优选叠氮化钠。更优选地，反应温度为30～35℃。作为本发明的优选方式，在反应体系中生成中间体e、中间体d、中间体b的之后，还包括：进行萃取和/或纯化的步骤，以提高后续反应的反应效率，获得良好的后产物。较佳地，所述的纯化为结晶纯化。作为本发明的优选方式，在进行碱解反应生成化合物a之后，还包括步骤：在获得了式a的化合物粗品之后，还通过结晶工序，进而获得高纯度的式a化合物。应理解，尽管本发明中提供了优选的结晶溶剂体系，但本领域已知的一些可替代溶剂体系也是可用于式a化合物的纯化的。作为本发明的优选方式，反应在惰性气体(更佳地为氩气或氮气)氛围下进行。作为本发明的优选方式，所述的方法的步骤(2)中，反应温度为40～45℃。作为本发明的优选方式，所述的方法的步骤(3)中，反应温度为-5～5℃。作为本发明的优选方式，所述的方法的步骤(4)中，反应温度为30±2℃。作为本发明的优选方式，所述的方法的步骤(5)中，反应温度为25±2℃。在本发明的具体实施例中，提供了一种式a化合物的制备方法，包括步骤：第一步，将化合物f溶于吡啶体系中，降温至0℃左右，然后加入r1-cl试剂，制得中间体e粗品；经结晶纯化处理后，得到中间体e纯品。第二步，将中间体e溶于dmso/醋酸体系中，然后控温40℃以下滴加入乙酸酐；然后45±2℃下搅拌反应，制得中间体d粗品；经结晶纯化处理后，得到中间体d纯品。第三步，将制得中间体d溶于二氯甲烷/环己烯体系中，然后降温至0±5℃后，滴加入磺酰氯，然后于0±5℃下搅拌反应，制得化合物c粗品；第四步，将浓缩后的化合物c粗品溶于dmf中，加入叠氮化试剂，然后于30±2℃下搅拌反应，制得化合物b粗品；经结晶纯化处理后，得到化合物b纯品。第五步，将化合物b溶于溶剂5中，加入碱试剂，然后于25±2℃下搅拌反应，制得化合物a粗品；经结晶纯化处理后，得到化合物a纯品。据此，本发明提供了有效且无需特别设备，适合大规模工业化生产，可得到高纯度3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷(式a化合物)的制备方法，可满足市场的需求。本发明还提供了新型化合物3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷，其可作为合成新型反义寡核苷酸的基础原料，可被应用于反义寡核苷酸的合成领域。并且，除可作为药物开发工具外，3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷还可用于科学研究，特别是功能基因组学研究。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，实施例中的定义各试剂的量的百分比(％)是质量体积比(w/v)。本发明下述实施例中的hplc(高效液相色谱)条件：柱：ymc-aqc185μm4.6*250mm流速：0.8ml/min波长：260nm流动相：a液：teaa缓冲液(0.1摩尔/升的乙酸水溶液用三乙胺调至ph＝7.0)。b液：色谱级乙腈。分析过程中a液，b液在线脱气，氦气流速50ml/min。梯度：时间(min)a％b％010004100082080162080201000301000实施例1、中间体e的制备将20kg化合物f(2’-o-me-n4-bz-胞嘧啶核苷，cas:52571-45-6)用200l吡啶(py)溶解后减压带水一次，水浴设温60℃。然后再次加入200l吡啶将浓缩剩余物溶解，然后溶液搅拌降温至0±2℃，体系中加入10.9kgtbdms-cl。加完后，体系维温0±2℃下搅拌反应，20小时后，取样hplc监控，原料剩余0.2％，结束反应。向釜中加入乙醇5l，加完后，搅拌10～30分钟；再向体系中加入10.93kgnahco3固体，体系于25±10℃下搅拌2～5小时。然后将体系于50±2℃下减压浓缩至不滴为止。浓缩剩余物溶于200l乙酸乙酯，体系用200l饱和盐水萃取三次，水相弃去。有机相用20kg无水na2so4干燥后，过滤，用20l乙酸乙酯淋洗，后滤液于45±2℃下减压浓缩干。用100l乙酸乙酯于70℃下溶解固体，然后加入100l正庚烷，体系先于25±5℃下搅拌2小时，然于0±5℃下搅拌结晶12小时。过滤，固体用20l乙酸乙酯/正庚烷＝5/5的混合液淋洗，固体干燥后，得23.6kg中间体e，hplc纯度99.2％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.21(s,1h),8.32(d,j＝7.0hz,1h),8.01(d,j＝7.0hz,2h),7.63-7.60(m,1h),7.52-7.49(m,2h),7.37(d,j＝5.0hz,1h),5.88(d,j＝3.5hz,1h),5.14(d,j＝6.5hz,1h),4.30-4.27(m,1h),4.05-4.00(m,2h),3.55-3.53(m,1h),3.46-3.42(m,1h),3.29(s,3h),0.88(s,9h)0.09(s,6h).实施例2、中间体d的制备将10kg中间体e置于反应釜中，加入46.2kgdmso和44.1kgacoh将其溶解，循环水冷却下搅拌，再加入20.7kgac2o，控制加入速度，控制内温小于40℃。加完后控温45±2℃下搅拌，反应12小时后，取样hplc，原料剩余0.5％，结束反应。反应完后，体系降温至20±5℃。体系用100l乙酸乙酯稀释后用10％氯化钠水溶液100l*6萃取六次，水相合并后用10l乙酸乙酯反萃一次后弃去，合并乙酸乙酯相，用5％碳酸氢钠水溶液100l*6萃取六次，水相合并后用10l乙酸乙酯反萃一次后弃去。合并有机相，用10kgna2so4干燥后，过滤，10l乙酸乙酯淋洗固体，滤液于50±2℃下减压至不滴为止，然后加入20l乙酸乙酯于75±2℃下溶解，然后加入80l正庚烷。体系于20±5℃下搅拌至有固体析出后静置12小时后过滤，固体用5l乙酸乙酯/正庚烷＝2/8的混合溶液淋洗，固体干燥后，得10.6kg中间体d，hplc纯度99.5％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.20(s,1h),8.30(d,j＝7.0hz,1h),8.00(m,2h),7.64-7.60(m,1h),7.53-7.51(m,2h),7.35(m,1h),6.21(d,j＝3.5hz,1h),4.68(d,j＝6.5hz,1h),4.60(d,j＝6.5hz,1h),4.25-4.22(m,1h),4.03-3.99(m,2h),3.53-3.51(m,1h),3.45-3.43(m,1h),3.29(s,3h),2.13(s,3h),0.88(s,9h)0.09(s,6h).实施例3、化合物c的制备将6.5kg中间体d置于反应釜中，用65l二氯甲烷溶解，再加入6.5l环己烯，加完后降温至-5±5℃下搅拌，3.47kgso2cl2先用15l二氯甲烷稀释后滴加入釜中，控内温0度以下。滴完后于0±5℃下搅拌反应2小时后，取样hplc监控，原料剩余0.8％，结束反应。将体系于10±2℃下减压浓缩至不滴为止，然后再加入65l的dmf体系再于10±2℃下减压浓缩20分钟，去除干净二氯甲烷，制得化合物c粗品，无需纯化，直接用于下一步反应。实施例4、化合物b的制备向上一步反应釜中一次性加入4.69kgnan3，然后体系于30±2℃下搅拌反应。反应2小时后，取样hplc监控，原料化合物c剩余0.2％，结束反应。反应完后，体系用130l乙酸乙酯稀释。体系用10％氯化钠水溶液65l*6萃取六次，水相合并后用10l乙酸乙酯反萃一次后弃去。合并乙酸乙酯相，用10％氯化钠水溶液65l*4再次萃取四次，水相合并后用10l乙酸乙酯反萃一次后弃去。合并有机相，用6.5kgna2so4干燥后，过滤，用10l乙酸乙酯淋洗固体，滤液于45±2℃下减压至不滴为止。然后加入32.5l乙酸乙酯于75±2℃下溶解，然后加入32.5l正庚烷。体系于20±5℃下搅拌至有固体析出后静置12小时后过滤，固体用5l乙酸乙酯/正庚烷＝5/5的混合溶液淋洗，固体干燥后，得6.1kg化合物b，hplc纯度99.4％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.22(s,1h),8.31(d,j＝7.0hz,1h),8.02(m,2h),7.63-7.60(m,1h),7.55-7.52(m,2h),7.33(m,1h),6.24(d,j＝3.5hz,1h),4.76(d,j＝9.0hz,1h),4.62(d,j＝9.0hz,1h),4.21-4.17(m,2h),4.13-4.11(m,1h),4.08-4.06(m,1h),4.03-4.00(m,1h),3.27(s,3h),0.87(s,9h)0.09(s,6h).实施例5、化合物a的制备将6kg化合物b置于反应釜中，加入48l乙醇和12l去离子水，搅拌溶解，降温至20±5℃，然后加入2kgnaoh固体。加完后，体系于25±2℃下搅拌，反应2小时后，取样hplc，原料化合物b剩余0.31％，结束反应。将体系ph值用6n盐酸调节至7-8后，反应液于45±2℃下减压浓缩至不滴为止。剩余物用120l去离子水复溶后，用脱盐膜反复脱盐四次，去除生成的氯化钠，然后于45±2℃下减压浓缩干，剩余物用30l无水乙醇于75±2℃下搅拌溶解，然后体系于20±5℃下搅拌至有固体析出后静置2小时后，于0±5℃下搅拌12小时后过滤，固体用3l乙醇淋洗，固体干燥后，得2.8kg化合物a，hplc纯度99.6％。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ(ppm):11.25(s,1h),8.49(d,j＝7.5hz,1h),7.97(m,2h),7.64-7.60(m,2h),7.54-7.51(m,2h),6.22(d,j＝3.5hz,1h),4.78(s,2h),4.31-4.27(m,2h),4.23-4.21(m,1h),4.16-4.13(m,1h),4.11-4.08(m,1h),3.26(s,3h).实施例6、3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷合成下游产品的工艺利用3’-o-ch2n3-2’-o-me-胞嘧啶核苷合成下游产品的主要工艺流程如下：根据以上工艺流程，获得有用的下游产物，应用于反义寡核苷酸药物领域。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。当前第1页12