本发明涉及龙胆苦苷的提取分离纯化技术领域，具体为一种从秦艽中提取龙胆苦苷的分离纯化工艺。
背景技术
利用d101大孔树脂的分离能力和有效成分在溶剂中溶解度不同分离纯化得到高纯度的龙胆苦苷，用到的技术有hplc检测法，薄层层析发，重结晶技术，存在的缺点是原料的质量难以控制，利用大孔树脂进行粗分是溶液的收集开始点和结束点难以控制，在重结晶的过程中浓缩液的比重不容易控制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种秦艽从秦艽中提取龙胆苦苷的分离纯化工艺，本发明提高了龙胆苦苷的提取率，分离纯度并提高总体收率，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种从秦艽中提取龙胆苦苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
步骤1)：提取溶剂的选择、提取温度的控制，通过对不同提取溶剂和不同提取温度进行正交试验确定出最佳的提取溶剂为纯化水；
步骤2)：利用大孔树脂对提取液进行初步的分离纯化时应选用何种树脂，哪种对龙胆苦苷的吸附能力最大，并有利于解析附，分别取d101大孔树脂、ab-8大孔树脂、d301大孔树脂进行最大静态大吸附量和最大解吸附量的确定，得出d101大孔树脂吸附量最大；
步骤3)：利用大孔树脂进行粗分离时，洗脱剂的种类的选择，洗脱剂浓度的确定，洗脱剂用量的确定，洗脱液收集开始点和结束点的确定；
步骤4)：利用d101大孔树脂对洗脱液进行进一步除杂和脱水处理；
步骤5)：在对得到的洗脱液进行重结晶时，对重结晶条件的选择；
步骤6)：对得到的龙胆苦苷粗品进行纯化时纯化条件的选择。
优选的，步骤1)的提取温度为97℃。
优选的，步骤3)还包括如下步骤：
步骤3-1)：洗脱剂的选择：分别选用水、甲醇和乙醇作为洗脱剂进行解吸附实验；
步骤3-2)：洗脱剂浓度和用量的选择：分别取5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％的醇度进行洗脱，随着乙醇浓度的增加乙醇对杂质和龙胆苦苷的洗脱能力都在逐渐增加，当达到25％时洗脱能力逐渐趋于平缓，通过以上实验确定出最佳的洗脱条件为先用纯净水洗脱1倍柱体积除去水溶性杂质，再用5％的乙醇洗脱1.5倍柱体积除去低脂溶性杂质，再用25％乙醇溶液洗脱3倍柱体积，收集洗脱液；
步骤3-3)：在收集洗脱剂时每1/2柱体积取一次样，利用hplc法进行检测，并利用薄层色谱法与之进行对比，确定最佳收集点，得到当洗脱液的浓度大于5％时开始收集，当25％的洗脱液流出3倍柱体积时停止收集；
优选的，步骤4)还包括如下步骤：
步骤4-1)：利用上述步骤中确定除杂条件对洗头液进行二次除杂；
步骤4-2)：最后利用95％的乙醇洗脱2倍柱体积，收集洗脱液浓缩至浸膏；
步骤4-3)：经过上述两次分离处理可以除去大部分的脂溶性的杂质和水溶性的杂质。
优选的，步骤5)还包括如下步骤：
步骤5-1)：将上述浸膏分成等量的9份，分别加入等量的乙醇、丙酮、乙酸乙酯进行初步纯化处理，通过对浸膏溶解度的观察发现乙醇对龙胆苦苷的溶解度最大，可确定乙醇作为纯化剂；
步骤5-2)：再取三分上述浸膏分别加入10倍量、20倍量、30倍量的乙醇溶解三次，观察实验结果，可知用30倍量的乙醇溶解2次可以将95％的龙胆苦苷溶解在溶液中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提出的从秦艽中提取龙胆苦苷的分离纯化工艺，采用d101大孔树脂作为分离树脂，利用d101大孔树脂大孔树脂进行粗分离后，利用d101大孔树脂对洗脱液进行进一步除杂和脱水处理，在对得到的洗脱液进行重结晶时，利用无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮对上述得到的粗品进行重结晶，得出无水乙醇的结晶率最好，产品的醇度最高，晶型稳定，利用d101大孔树脂的分离能力和有效成分在溶剂中溶解度不同分离纯化得到高纯度的龙胆苦苷，提高了龙胆苦苷的提取率，分离纯度并提高总体收率。
具体实施方式
以下将详细说明本发明实施例，然而，本发明实施例并不以此为限。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种从秦艽中提取龙胆苦苷的分离纯化工艺，包括如下步骤：
步骤1：提取溶剂的选择、提取温度的控制，通过对不同提取溶剂和不同提取温度进行正交试验确定出最佳的提取溶剂为纯化水，提取温度为97℃，提取率可达到90％以上；
步骤2：利用大孔树脂对提取液进行初步的分离纯化时应选用何种树脂，哪种对龙胆苦苷的吸附能力最大，并有利于解析附，分别取d101大孔树脂、ab-8大孔树脂、d301大孔树脂进行最大静态大吸附量和最大解吸附量的确定，得出d101大孔树脂吸附量最大，并有利于解析附，最大吸附量为2％，最大解吸附为95％，所以选用d101大孔树脂作为分离树脂最合适；
步骤3：利用大孔树脂进行粗分离时，洗脱剂的种类的选择，洗脱剂浓度的确定，洗脱剂用量的确定，洗脱液收集开始点和结束点的确定；
1)洗脱剂的选择：分别选用水、甲醇和乙醇作为洗脱剂进行解吸附实验的出乙醇的洗脱能力最强，且乙醇的毒性小，故选乙醇作为洗脱剂；
2)洗脱剂浓度和用量的选择：分别取5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％的醇度进行洗脱，可知5％的乙醇对龙胆苦苷的洗脱能力较差但对水溶性杂质的洗脱能力较强，随着乙醇浓度的增加乙醇对杂质和龙胆苦苷的洗脱能力都在逐渐增加，当达到25％时洗脱能力逐渐趋于平缓，当醇度在增加时对龙胆苦苷的洗脱能力保持能力不变但对脂溶性杂质的洗脱能力增强。通过以上实验确定出最佳的洗脱条件为先用纯净水洗脱1倍柱体积除去水溶性杂质，再用5％的乙醇洗脱1.5倍柱体积除去低脂溶性杂质，再用25％乙醇溶液洗脱3倍柱体积，收集洗脱液；
3)在收集洗脱剂时每1/2柱体积取一次样，利用hplc法进行检测，并利用薄层色谱法与之进行对比，确定最佳收集点，得到当洗脱液的浓度大于5％时开始收集，当25％的洗脱液流出3倍柱体积时停止收集；
步骤4：利用d101大孔树脂对洗脱液进行进一步除杂和脱水处理；
1)利用上述步骤中确定除杂条件对洗头液进行二次除杂；
2)最后利用95％的乙醇洗脱2倍柱体积，收集洗脱液浓缩至浸膏；
3)经过上述两次分离处理可以除去大部分的脂溶性的杂质和水溶性的杂质，每一次的分离收率可达到85％；
步骤5：在对得到的洗脱液进行重结晶时，对重结晶条件的选择，如重结晶所用的试剂、浓度、结晶的温度等；
1)将上述浸膏分成等量的9分分别加入等量的乙醇、丙酮、乙酸乙酯进行初步纯化处理，通过对浸膏溶解度的观察发现乙醇对龙胆苦苷的溶解度最大，可确定乙醇作为纯化剂；
2)再取三分上述浸膏分别加入10倍量、20倍量、30倍量的乙醇溶解三次，观察实验结果，可知用30倍量的乙醇溶解2次可以将95％的龙胆苦苷溶解在溶液中，可以除去水溶性杂质并可最大程度的保留龙胆苦苷。
步骤6：对得到的龙胆苦苷粗品进行纯化时纯化条件的选择。
本发明分别利用无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮对上述得到的粗品进行重结晶，得出无水乙醇的结晶率最好，产品的醇度最高，晶型稳定。
综上所述：本发明提出的从秦艽中提取龙胆苦苷的分离纯化工艺，采用d101大孔树脂作为分离树脂，利用d101大孔树脂大孔树脂进行粗分离后，利用d101大孔树脂对洗脱液进行进一步除杂和脱水处理，在对得到的洗脱液进行重结晶时，利用无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮对上述得到的粗品进行重结晶，得出无水乙醇的结晶率最好，产品的醇度最高，晶型稳定，利用d101大孔树脂的分离能力和有效成分在溶剂中溶解度不同分离纯化得到高纯度的龙胆苦苷，提高了龙胆苦苷的提取率，分离纯度并提高总体收率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。