本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种小鼠耳蜗毛细胞培养方法。
背景技术：
人类听力功能的基础是存在于颞骨耳蜗内的听觉感受器官，即柯蒂氏器(organofcorti)。柯蒂氏器内含有特殊的感觉上皮细胞，又称为毛细胞，可以将通过外耳和中耳传入内耳基底膜的声能转化为神经冲动传入大脑。大多数感音神经性耳聋是由于各种原因造成内耳毛细胞死亡或损伤所致。在现实生活中，有很多因素如噪音、耳神经毒性药物(氨基糖甙类抗生素、抗肿瘤药物等)和缺血等都可能造成内耳毛细胞损伤。因此，研究内耳毛细胞功能和损伤引起毛细胞的病理改变及其机制是了解感音神经性耳聋发生和发展的重要基础。
在进行体外培养试验时，一般采用小鼠作为实验对象，为了获得稳定的实验材料，对需要对小鼠耳蜗毛细胞进行体外培养，因此快速获得体外培养细胞，并且可以在体外条件下保证毛细胞的生物活性非常重要。但小鼠耳蜗较小，进行细胞分离及培养难度较大，因此提供一种分离简单，培养成功率高，细胞活性保持好的方法非常必要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够用于小鼠耳蜗毛细胞体外培养、稳定耳蜗毛细胞活性的专用培养液，以及应用该培养液培养耳蜗毛细胞的方法。该方法降低了小鼠耳蜗毛细胞的分离难度，细胞活性保持良好，成功率高。
首先发明人提供了用于培养毛细胞的培养液，其组成包括：葡萄糖3g、酚红钠0.01g、丙酮酸钾0.15g、盐酸左旋精氨酸0.08g、胱氨酸0.05g、丙氨酰谷氨酸0.90g、甘氨酸0.02g、组氨酸0.05g、亮氨酸0.12g、盐酸左旋赖氨酸0.15g、左旋蛋氨酸0.03g、苯丙氨酸0.07g、丝氨酸0.04g、左旋苏氨酸0.11g、左旋色氨酸0.02g、左旋酪氨酸0.07g、颉胺酸0.12g、泛酸鈣0.004g、氯化胆碱0.004g、叶酸0.004g、肌醇0.007g、烟酰胺0.004g、盐酸吡多辛0.004g、核黄素0.0004g、盐酸硫胺0.004g，培养液中还包含有无机盐，余量为蒸馏水；然后按照50-90ng/ml的浓度加入小分子多肽(该小分子多肽为专利cn107973838a中公开的小分子多肽)。
优选的，加入无机盐后使培养液的钾离子水平范围在130-145meq/l，钠离子水平范围为＜10meq/l。
应用上述培养液进行耳蜗毛细胞体外培养的方法，具体步骤如下：
选取出生后3天的小鼠，将生物安全柜严格紫外消毒至少30分钟，将备好的实验器械75％酒精浸泡并同时紫外消毒。75％的酒精喷洒小鼠头颈部进行表面皮肤消毒。在小鼠枕骨大孔处断头，沿矢状缝使用眼科剪去除头盖骨，使用镊子小心去除左右两侧的脑组织，沿中间剪开分离左右侧颞骨，将颞骨置入预冷无菌的ca2+-mg2+平衡的hank’s平衡盐溶液(hank’sbalancedsaltsolution，hbss)中。在放大25～40倍的解剖显微镜下使用5号精细镊子去除颞骨听泡及周围组织，暴露并分离出耳蜗(含蜗壳)；去除周边组织,分离出带柯替氏器的基底膜；显微分割出内毛细胞区及外毛细胞区，得到小段细胞簇；用带缓冲液的玻璃吸管分别吸取分割后的内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上获得离单的内外毛细胞，培养于上述培养液中，在co2细胞培养箱中培养，条件为20％o2，5％co2，75％n2，37℃，可保持细胞活性达5天以上。
本发明的优点和效果在于定位准确,单细胞活性质量高，工作量大大减少，本发明中应用的小分子多肽能够保持细胞的活性，能够更效率性的获得所需的体外培养细胞。本发明作为较接近内淋巴液离子成分的毛细胞专用培养液，可实现成熟耳蜗毛细胞体外活性稳定，为耳蜗毛细胞的体外研究快速持续提供实验材料。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
配制培养液，称取葡萄糖3g、酚红钠0.01g、丙酮酸钾0.15g、盐酸左旋精氨酸0.08g、胱氨酸0.05g、丙氨酰谷氨酸0.90g、甘氨酸0.02g、组氨酸0.05g、左旋异白氨酸0.13g、亮氨酸0.12g、盐酸左旋赖氨酸0.15g、左旋蛋氨酸0.03g、苯丙氨酸0.07g、丝氨酸0.04g、左旋苏氨酸0.11g、左旋色氨酸0.02g、左旋酪氨酸0.07g、颉胺酸0.12g、泛酸鈣0.004g、氯化胆碱0.004g、叶酸0.004g、肌醇0.007g、烟酰胺0.004g、盐酸吡多辛0.004g、核黄素0.0004g、盐酸硫胺0.004g，培养液中还包含有无机盐，余量为蒸馏水；然后按照50ng/ml的浓度加入小分子多肽(该小分子多肽为专利cn107973838a中公开的小分子多肽)，加入无机盐后使培养液的钾离子水平范围在130meq/l，钠离子水平范围为＜10meq/l。
选取出生后3天的小鼠，将生物安全柜严格紫外消毒至少30分钟，将备好的实验器械75％酒精浸泡并同时紫外消毒。75％的酒精喷洒小鼠头颈部进行表面皮肤消毒。在小鼠枕骨大孔处断头，沿矢状缝使用眼科剪去除头盖骨，使用镊子小心去除左右两侧的脑组织，沿中间剪开分离左右侧颞骨，将颞骨置入预冷无菌的ca2+-mg2+平衡的hank’s平衡盐溶液(hank’sbalancedsaltsolution，hbss)中。在放大25～40倍的解剖显微镜下使用5号精细镊子去除颞骨听泡及周围组织，暴露并分离出耳蜗(含蜗壳)；去除周边组织,分离出带柯替氏器的基底膜；显微分割出内毛细胞区及外毛细胞区，得到小段细胞簇；用带缓冲液的玻璃吸管分别吸取分割后的内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上获得离单的内外毛细胞，培养于上述培养液中，在co2细胞培养箱中(20％o2，5％co2，75％n2，37℃)培养保持活性可达5天。
实施例2
配制培养液，称取葡萄糖3g、酚红钠0.01g、丙酮酸钾0.15g、盐酸左旋精氨酸0.08g、胱氨酸0.05g、丙氨酰谷氨酸0.90g、甘氨酸0.02g、组氨酸0.05g、左旋异白氨酸0.13g、亮氨酸0.12g、盐酸左旋赖氨酸0.15g、左旋蛋氨酸0.03g、苯丙氨酸0.07g、丝氨酸0.04g、左旋苏氨酸0.11g、左旋色氨酸0.02g、左旋酪氨酸0.07g、颉胺酸0.12g、泛酸鈣0.004g、氯化胆碱0.004g、叶酸0.004g、肌醇0.007g、烟酰胺0.004g、盐酸吡多辛0.004g、核黄素0.0004g、盐酸硫胺0.004g，培养液中还包含有无机盐，余量为蒸馏水；然后按照90ng/ml的浓度加入小分子多肽(该小分子多肽为专利cn107973838a中公开的小分子多肽)，加入无机盐后使培养液的钾离子水平范围在145meq/l，钠离子水平范围为＜10meq/l。
选取出生后3天的小鼠，将生物安全柜严格紫外消毒至少30分钟，将备好的实验器械75％酒精浸泡并同时紫外消毒。75％的酒精喷洒小鼠头颈部进行表面皮肤消毒。在小鼠枕骨大孔处断头，沿矢状缝使用眼科剪去除头盖骨，使用镊子小心去除左右两侧的脑组织，沿中间剪开分离左右侧颞骨，将颞骨置入预冷无菌的ca2+-mg2+平衡的hank’s平衡盐溶液(hank’sbalancedsaltsolution，hbss)中。在放大25～40倍的解剖显微镜下使用5号精细镊子去除颞骨听泡及周围组织，暴露并分离出耳蜗(含蜗壳)；去除周边组织,分离出带柯替氏器的基底膜；显微分割出内毛细胞区及外毛细胞区，得到小段细胞簇；用带缓冲液的玻璃吸管分别吸取分割后的内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上获得离单的内外毛细胞，培养于上述培养液中，在co2细胞培养箱中(20％o2，5％co2，75％n2，37℃)培养可保持活性达到5天以上。
实施例3
配制培养液，称取葡萄糖3g、酚红钠0.01g、丙酮酸钾0.15g、盐酸左旋精氨酸0.08g、胱氨酸0.05g、丙氨酰谷氨酸0.90g、甘氨酸0.02g、组氨酸0.05g、左旋异白氨酸0.13g、亮氨酸0.12g、盐酸左旋赖氨酸0.15g、左旋蛋氨酸0.03g、苯丙氨酸0.07g、丝氨酸0.04g、左旋苏氨酸0.11g、左旋色氨酸0.02g、左旋酪氨酸0.07g、颉胺酸0.12g、泛酸鈣0.004g、氯化胆碱0.004g、叶酸0.004g、肌醇0.007g、烟酰胺0.004g、盐酸吡多辛0.004g、核黄素0.0004g、盐酸硫胺0.004g，培养液中还包含有无机盐，余量为蒸馏水；然后按照70ng/ml的浓度加入小分子多肽(该小分子多肽为专利cn107973838a中公开的小分子多肽)，加入无机盐后使培养液的钾离子水平范围在140meq/l左右，钠离子水平范围为＜10meq/l。
选取出生后3天的小鼠，将生物安全柜严格紫外消毒至少30分钟，将备好的实验器械75％酒精浸泡并同时紫外消毒。75％的酒精喷洒小鼠头颈部进行表面皮肤消毒。在小鼠枕骨大孔处断头，沿矢状缝使用眼科剪去除头盖骨，使用镊子小心去除左右两侧的脑组织，沿中间剪开分离左右侧颞骨，将颞骨置入预冷无菌的ca2+-mg2+平衡的hank’s平衡盐溶液(hank’sbalancedsaltsolution，hbss)中。在放大25～40倍的解剖显微镜下使用5号精细镊子去除颞骨听泡及周围组织，暴露并分离出耳蜗(含蜗壳)；去除周边组织,分离出带柯替氏器的基底膜；显微分割出内毛细胞区及外毛细胞区，得到小段细胞簇；用带缓冲液的玻璃吸管分别吸取分割后的内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上获得离单的内外毛细胞，培养于上述培养液中，在co2细胞培养箱中(20％o2，5％co2，75％n2，37℃)培养可保持活性达到4天以上。