一种与长江水系邗江、瑞昌草鱼生长相关的SNP标记的制作方法

本发明涉及snp标记及其应用技术领域，具体地说，是一种与长江水系邗江、瑞昌草鱼生长相关的snp标记。

背景技术：

肌肉生长抑制素(myostatin，mstn)基因是转化生长因子β家族成员之一，具有抑制肌肉分化和生长的作用。卵泡抑素(follistatin，fst)基因是一种激活素结合蛋白，在所有组织中均有表达，具有抑制mstn基因的作用，促进肌肉的生长。目前，在哺乳动物方面对mstn基因和fst基因的功能及调控机理开展了大量研究。在水产动物方面，主要研究了斑马鱼、虹鳟、罗非鱼、黑头呆鱼、草鱼等鱼类的mstn基因和fst基因的cdna克隆与表达，功能研究相对较少。mstn基因的多态性在哺乳动物和水产动物中均有相关报道，fst基因的多态性研究甚少。

草鱼(ctenopharyngodonidella)属雅罗鱼亚科(leuciscinae)、草鱼属(ctenopharyngodon)，是我国淡水养殖鱼类中年产量最大的养殖对象，因草鱼生长速度快，肉质鲜美，深受人们喜爱。目前养殖草鱼还有一定的效益空间，但从生产支出看，2008年以来饲料成本不断上涨，饲料成本占了草鱼养殖的70％以上成本。选育出生长速度更快的草鱼品种可以节约饲料成本，缩短养殖周期进而大幅度降低草鱼养殖成本，因此，开发快速可靠的育种技术，进行草鱼快长品种(系)的培育十分必要。

本课题组将对我国7个群体的草鱼：石首草鱼、长沙草鱼、瑞昌草鱼、邗江草鱼、靖江草鱼、嘉兴草鱼和松江草鱼的fst1、fst2、mstn1和mstn2基因部分序列进行snp位点的挖掘及其在不同群体草鱼中的差异分析，以期为深入开展基因型多态性与优良草鱼肌肉生长的相关性提供理论依据。

中国专利文献cn106381331a公开了一种草鱼生长速度相关的snp标记及其应用，通过对npy基因部分片段进行扩增，通过snapshotsnp分型方法，提供一种草鱼生长速度相关的snp标记，其中，s1位于npy基因的内含子1序列中自起始密码子(atg，以atg的第一个核苷酸为第一位)起第639位，且该位置处碱基为t或a；s2位于npy基因的内含子1序列中自起始密码子起第892位，且该位置处碱基为c或a；这两个snp位点可用于鉴定或选育生长速度较快的草鱼，为筛选和建立草鱼快长新品系奠定基础。中国专利文献cn106755527a公开了一种用于评价草鱼生长性能的snp标记、引物及评价方法，利用分子遗传学及分子生物学的方法获得用于评价草鱼生长性能的snp标记(包括snp1和snp4)及用于扩增snp位点所在基因片段的引物对，其中，snp1位于草鱼myod基因全序列的启动子中第940位，且该位置处为t碱基插入或缺失；snp4位于草鱼myod基因全序列的第一内含子中第107位，且该位置处碱基为a或t，通过检测这两个snp位点的单倍型，判定草鱼的生长性能，由于所用的单倍型是依据myod基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证；利用该snp标记的单倍型可以简单快速的鉴定快长草鱼，也可用于指导选育快长草鱼新品系。但是，有关本发明中草鱼fst基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)的研究均未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种与长江水系邗江、瑞昌草鱼生长相关的snp标记。

本发明的第二个目的是，提供一种用于检测上述snp标记的引物对。

本发明的第三个目的是，提供一种用于检测上述snp标记的试剂盒。

本发明的第四个目的是，提供上述snp标记、引物对及试剂盒的用途。

本发明的第五个目的是，提供一种鉴别长江水系邗江、瑞昌草鱼的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种与长江水系邗江、瑞昌草鱼生长相关的snp标记，所述snp标记位于fst1基因的外显子中，在seqidno:1所示序列第5位，该位置处碱基是c或a，用y表示，seqidno:1所示核苷酸序列如下：

tgcayagagacgtgccgtgatgtcctgtgtccgggaagttcgacttgtgtggtggaccagacaaacaacgcgtactgtgtgacatgcaaccgcatatgcccagaggttacgtctccggatcagtacctttgtggcaacgatgggattgtttacgccagcgcgtgccatttaaggagagccacgtgcttgctcgg。

其中，邗江、瑞昌草鱼第5位碱基为c，长江水系其他草鱼第5位碱基为a，碱基由a错义突变为c，改变了氨基酸序列的构成，由赖氨酸(lys)转变为了色氨酸(thr)。

实验发现，邗江、瑞昌草鱼体生长速度及质量显著高于长江水系其他草鱼，进而通过检测草鱼的上述snp标记，能够在相同养殖条件下有效挑选体生长速度较快的邗江、瑞昌草鱼，并淘汰生长速度较慢的其他草鱼，进一步的，本发明的snp标记能够用于草鱼的分子标记辅助育种，进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代，对草鱼苗种生产有积极意义，并可以大大节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测上述snp标记的引物对，所述引物对所述引物对具有seqidno:2-3所示的核苷酸序列。利用引物对能够有效地对上述snp标记位点所在的片段进行pcr扩增，达到快速检测snp标记的基因型、降低检测成本的目的。具体地，本发明的引物对的序列如下所示：

seqidno:2：f2-ctgcggccctgggaagagatgtaaa

seqidno:3：r2-acaccaatggatctgccgagcaagc

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测上述snp标记的试剂盒，所述试剂盒包含seqidno:2-3所示引物对。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

上述snp标记、引物对或试剂盒，在鉴别和选育邗江、瑞昌草鱼品种中的应用。如前所述，通过能够用于检测本发明的snp标记的试剂，例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测草鱼的上述snp标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测草鱼的性状，从而能够有效辅助草鱼选育工作。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种鉴别长江水系邗江、瑞昌草鱼和长江水系其它草鱼的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)提取待测草鱼dna；

2)用权利要求3所述的引物对将dna进行pcr扩增，获得扩增产物；

3)对步骤2)获得的pcr扩增产物进行测序，根据测序结果确定是否为长江水系邗江、瑞昌草鱼。

优选地，所述长江水系其它草鱼为长江流域的石首草鱼、长沙草鱼、靖江草鱼、嘉兴草鱼和松江草鱼。

本发明的提取待测草鱼dna的方法不受特别限制，可以采用任何已知的dna提取方法提取，也可采用试剂盒提取，本发明中的具体实施例是采用试剂盒提取。

本发明将所述待测草鱼的dna进行pcr扩增的条件不受特别限制。根据本发明的具体实施例，pcr扩增的扩增体系为50μl：模板dna60～100ng，10×taqbuffer5μl，dntpmixture(2.5mm)2μl，taq酶(2.5u/μl)1μl，上、下游引物(10μm)各1μl，0.1％depc处理过的去离子水补至50μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s～90s，35个循环；72℃后延伸10min，4℃终止反应。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的snp标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。

本发明对所述pcr扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得pcr扩增产物即snp标记所在的片段的序列即可。

本发明优点在于：

1、本发明经研究发现，长江水系邗江、瑞昌草鱼在fst1基因的外显子中发生碱基突变，改变了氨基酸序列的构成，由赖氨酸(lys)转变为了色氨酸(thr)，从而使得其生长速度及质量均优于长江水系其它草鱼。

2、本发明提供的snp标记不受草鱼的年龄、性别等限制，可用于长江水系邗江、瑞昌草鱼的早期选育，降低亲本筛选的盲目性，节约养殖成本，缩短养殖周期。

附图说明

图1是长江水系草鱼mstn2基因snp测序图；其中，(a):a/a纯合型，(b):a/g杂合型，(c):g/g纯合型。

图2是长江水系不同草鱼群体fst1、fst2、mstn1和mstn2基因snp位点统计。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

实验样本分别为长江流域的石首草鱼、长沙草鱼、瑞昌草鱼、邗江草鱼、靖江草鱼、嘉兴草鱼和松江草鱼(表1)，共7个群体的草鱼。每个群体草鱼剪取鳍条迅速放于95％乙醇中，-20℃保存待用。

表1实验用长江水系草鱼样本信息

1.2方法

1.2.1dna提取和引物来源

提取7个群体草鱼dna，使用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(购自北京天根生物有限公司)提取基因组dna，经1.2％琼脂糖凝胶电泳和smartspec^tmplus分光光度计(购自bio-rad公司)检测其纯度和浓度，作为pcr扩增的模板。fst1、fst2、mstn1和mstn2各基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物序列及长度如表2所示。

1.2.2pcr扩增

pcr反应体系为50μl，模板dna60～100ng，10×taqbuffer5μl，dntpmixture(2.5mm)2μl，taq酶(2.5u/μl)1μl，上、下游引物(10μm)各1μl，0.1％depc处理过的去离子水补至50μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s～90s，35个循环；72℃后延伸10min，4℃终止反应。

1.2.3测序

取3μlpcr扩增产物，经2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，电泳条带符合送测要求后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.2.4数据统计分析

根据测序峰型图对测序结果进行校正，剔除两端不准确的片段。利用mutationsurveyor软件分析测序后的碱基序列，以波峰整齐，无杂峰，碱基突变位点出现大于等于2次，且符合杂合位点的标准(当低峰值/主峰值≥0.3时，为杂合位点，反之为模糊位点，无法判断)，统计snp数量；用popgene1.32软件分析各位点的等位基因频率。

表2草鱼肌肉生长调控基因fst1、fst2、mstn1和mstn2引物序列

注：因草鱼全基因组未知，所以用斑马鱼fst1、fst2、mstn1和mstn2基因结构为参照。

1.2.5试验材料及管理

长江水系7个群体的草鱼亲本保存于上海海洋大学农业部团头鲂育种中心。挑取6龄优良草鱼亲本进行人工繁殖，雌雄草鱼各8尾，每尾约25kg。将每个群体的受精卵分别放到孵化桶里进行孵化，待受精卵孵化成平游的鱼苗后，取每个群体鱼苗约1000尾放到6m×4m×1.5m的水泥池中暂养，第80天通过剪鳍标记法对长江水系7个群体的f1后代进行vie可视嵌入性荧光标记，各群体随机挑选50尾称量体质量后同池混养，设置3个平行试验组，约每隔30天对每个家系补剪鳍后放回原水泥池，经过200天饲养，进行生长指标测量。

1.2.6生长指标测量

用电子称测量体质量，精确到0.01g；用直尺、圆规测量全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚形态性状，精确到0.1cm。

2结果与分析

2.1pcr检测结果及snp位点的统计

针对草鱼fst1、fst2、mstn1和mstn2四个基因的不同区域，共设计9对引物，经pcr扩增后，其扩增产物片段大小与预期目的片段大小相符，条带清晰明亮且无杂带，符合直接测序的要求。本实验中共送测样本量378个。

测序后的碱基序列以波峰整齐，无杂峰，出现2次以上(包括2次)且符合杂合位点标准的，记为有效snp位点。碱基突变位点存在3种基因型，在测序峰型图中表现为两种形式即纯合型和杂合型，纯合型snp的测序峰为单一峰型(见图1a、c)，而杂合型为双峰型(见图1b)。

2.2草鱼不同群体snp特征分析

pcr扩增产物经直接测序整理后，用于分析的fst1、fst2、mstn1和mstn2序列长度分别为1606bp、2203bp、986bp和2496bp，共7291bp。fst1、fst2、mstn1和mstn2snp出现频率分别约为1.00％、0.64％、0.51％和0.76％(见表3)，平均约每135bp出现一个snp位点。碱基置换类型结果表明：主要置换类型为转换(见表3，表4)，转换和颠换的比例约为3:2。在34个转换中，20个是转换，14个是转换。在20个颠换中，11个是颠换，8个是颠换，1个是颠换。snp数目检测结果表明：四个基因共检测到54个snp位点，mstn2检测到的snp数最多，为19个，而mstn1检测到的snp数最少，为5个。其snp位点的分布状况为：51个处于内含子区域，3个处于外显子区域且仅存在于fst1基因中。fst2、mstn1和mstn2中发现的snp全部位于内含子区域。

表3长江水系草鱼不同群体fst1、fst2、mstn1和mstn2片段中snp数量及分布

表中各基因的长度系不同引物扩增碱基数的和，扩增片段数见括号。

2.3草鱼不同群体fst1、fst2、mstn1和mstn2基因snp分布

在378个长江水系草鱼送测样本中共检测出54个突变位点，其中34个属于常见snp，另外20个属于罕见snp(最小等位基因频率小于10％)，每个snp位点在所测草鱼样品中的突变率为4.76％-83.33％，snp在7个草鱼群体中的具体分布见表4。瑞昌草鱼发现的突变位点最多，共有45个碱基突变位点，其中在fst1和fst2基因中发现的snp位点最多，均达到了14个；长沙草鱼中筛选到的突变位点最少，只有27个碱基突变位点，其中在fst2、mstn1和mstn2基因中分布的snp位点在7个群体草鱼中最少，分别为5个、1个和8个；嘉兴草鱼、邗江草鱼和松江草鱼含有的突变位点一样，均为39个，但是嘉兴草鱼在fst1基因中snp数量最少，邗江草鱼在mstn2基因中分布的snp位点最多；石首草鱼含有40个碱基突变位点；靖江草鱼存在38个碱基突变位点(见图2)。

表4长江水系不同草鱼群体fst1、fst2、mstn1和mstn2基因54个snp多态位点的分布

注：fst1引物f1/r1检测到的snp位点依次记为snp1、snp2、snp3、snp4、snp5，引物f2/r2检测到的snp位点依次记为snp6、snp7、snp8、snp9、snp10、snp11、snp12，引物f3/r3检测到的snp位点依次记为snp13、snp14、snp15、snp16；fst2、mstn1和mstn2引物检测到的snp位点依次记为方法同fst1。上标1：石首草鱼，2：长沙草鱼，3：瑞昌草鱼，4：邗江草鱼，5：靖江草鱼，6：嘉兴草鱼，7：松江草鱼。

如表4所示，长江水系草鱼7个群体的任意群体间存在13-30个差异snp位点。其中，长沙草鱼与其它草鱼群体之间均存在较大的差异(20-30个)，与松江草鱼之间差异最大，为30个snp差异，与嘉兴草鱼、邗江草鱼间snp差异最小，为20个；靖江草鱼与邗江草鱼、松江草鱼和瑞昌草鱼之间差异最少，仅为13个snp差异，与嘉兴草鱼间存在15个snp差异，与石首草鱼之间存在16个snp差异；嘉兴草鱼与松江草鱼之间存在的snp差异，相对嘉兴草鱼与其它群体之间存在的snp差异最少，仅为14个；石首草鱼与瑞昌草鱼间snp差异，相对与石首草鱼与其它群体草鱼间存在的snp位点差异最少，为15个snp差异。

在长江水系草鱼7个群体中，绝大多数(94％)的snp存在于4个基因的内含子区域，仅fst1基因在第3外显子区域发现3个snp位点，其中2个为错义突变，1个为同义突变。其中，fst1基因的snp7位点为错义突变，由赖氨酸(lys)转变为色氨酸(thr)，该突变仅存于邗江和瑞昌草鱼群体中(表4)。snp8位点为错义突变，由赖氨酸(lys)变为谷氨酸(glu)，snp6位点为同义突变，这两个突变存于长江水系全部7个草鱼群体中(表4)。

2.4草鱼不同群体的生长差异分析

表5长江水系不同草鱼群体生长差异分析

其中，fst1基因snp7位点的极性氨基酸赖氨酸(lys)转变为非极性氨基酸色氨酸(thr)的错义突变与生长性状密切关联。由表5可知，尽管均为长江水系群体，存在该突变的邗江和瑞昌草鱼群体f1代的生长速度显著高于其他几个群体。表5显示：第80天，平均体质量最大的为邗江和瑞昌群体；第200天，平均体质量和绝对体质量增加率最大的也均为邗江和瑞昌群体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海海洋大学

<120>一种与长江水系邗江、瑞昌草鱼生长相关的snp标记

<130>/

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>194

<212>dna

<213>草鱼(ctenopharyngodonidella)

<400>1

tgcayagagacgtgccgtgatgtcctgtgtccgggaagttcgacttgtgtggtggaccag60

acaaacaacgcgtactgtgtgacatgcaaccgcatatgcccagaggttacgtctccggat120

cagtacctttgtggcaacgatgggattgtttacgccagcgcgtgccatttaaggagagcc180

acgtgcttgctcgg194

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctgcggccctgggaagagatgtaaa25

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acaccaatggatctgccgagcaagc25