与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229标记及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体涉及与玉米株高紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术：

玉米(zeamaysl.)是我国第一大粮食作物，在我国能源与粮食安全中占有举足轻重的位置，株高影响到玉米的抗倒性、光合效能、收获指数，与玉米产量密切相关，因此，在玉米育种实践与种质资源改良工作中，株高性状具有重要的价值。

玉米株高具有复杂的遗传基础，连锁作图、关联分析等方法被用于玉米株高的研究，一方面，连锁作图和关联分析的方法被用来发掘影响株高的靶点，另一方面，矮秆突变体被用来解析株高调控的机制。尽管有一些调控玉米株高的基因被定位与克隆，例如qph3.1、br2等，尚未见indel6和ssr229分子标记用于玉米株高辅助选择育种的研究报道。因此，开发与玉米株高基因相关的indel6和ssr229标记，可以为玉米株型改良与育种工作提供理论参考与实践素材。

技术实现要素：

本发明提供了两个与玉米株高紧密连锁的分子标记，分别为indel6和ssr229标记。

本发明还分别提供了一对用于检测与玉米株高紧密连锁的indel6和ssr229两个分子标记的引物，包括indel6的正向引物5′-tgtggacgtgacacgctt-3′和反向引物

5′-tcagccttcgtccacagac-3′；ssr229的正向引物

5′-gggtctttcgctgaataacact-3′和反向引物5′-caaccctcactactaaagccga-3′。

本发明还提供了一种用于检测与玉米株高紧密连锁的indel6和ssr229分子标记的筛选方法，通过采用玉米55ksnp芯片，在亲本、混池间筛选多态性分子标记；根据玉米重测序的结果，开发indel标记indel6、ssr标记ssr229，并在玉米株型改良育种中进行运用，从而加速玉米理想株型品种(品系)的选育进程。同时，发展的分子标记也为玉米株高基因克隆、种质改良创新、理想株型新品种选育提供了理论参考与实践素材。为实现上述目的，本发明采用的具体步骤如下：

(1)对高秆和矮秆高世代回交群体bc6进行株高的表型鉴定；

(2)采用玉米55ksnp芯片、集团分离分析bsa的方法，对混池、单株dna进行基因型检测，完成玉米株高基因的初步定位；

(3)根据基因初步定位的结果，基于玉米基因组重测序的结果，在初步定位的基因区域开发indel、ssr标记，并设计对应的indel、ssr引物；

(4)利用设计的indel、ssr引物，筛选在两个亲本、高秆和矮秆混池间呈现多态性的引物，利用多态性的引物对bc、f2群体进行基因型鉴定；

(5)根据indel、ssr分子标记基因型鉴定的结果，鉴定交换单株，分析所发展分子标记与株高基因的连锁程度，发掘紧密连锁的分子标记。

本发明利用上述技术措施，最终获得与玉米株高紧密连锁的indel6和ssr229标记，对应玉米参考基因组物理图谱的位置分别是：indel6位于十号染色体的122642049bp，ssr229位于十号染色体的122789702bp。indel6引物序列为f：5′-tgtggacgtgacacgctt-3′，r：

5′-tcagccttcgtccacagac-3′；ssr229引物序列为f：

5′-gggtctttcgctgaataacact-3′，r：5′-caaccctcactactaaagccga-3′。

本发明另一个目的是鉴定玉米株高分子标记indel6和ssr229在玉米理想株型育种中的应用。

本发明提供的方法，具体方法是：

(1)利用发展的indel、ssr分子标记，对bc、f2群体每个株系进行基因型鉴定。

(2)利用上述(1)中bc、f2群体基因型鉴定的结果，根据鉴定结果，对单株进行高秆、矮秆分类，对表型分析的结果进行鉴定和验证。

本发明的有益效果：

本发明的分子标记indel6和ssr229表现稳定，检测简易，不需酶切，电泳条带清晰，实验成本低廉，提高了玉米株型改良的效率，加快了玉米理想株型育种的进程。

本发明的标记与控制玉米株高的基因紧密连锁，有利于玉米株高基因的克隆与功能验证。

本发明设计的引物indel6和ssr229扩增稳定、灵敏度高、特异性强。

附图说明

图1是ssr标记umc2350检测bc群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳图显示，标记umc2350在bc群体高秆单株、矮秆单株间呈现多态性。

图2是ssr标记umc1697检测bc群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图3是ssr标记ssr51、ssr229检测bc群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图4是ssr标记ssr-z60检测bc群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图5是indel标记indel6检测bc群体高秆池、矮秆池的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图6是indel标记indel6检测120份高秆材料、矮秆材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图7是ssr标记ssr229检测120份高秆材料、矮秆材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

具体实施方式

实施例1

一、基因定位群体的构建

1、bc群体的构建

玉米自交系mo17(母本)，是玉米育种实践与基础研究的骨干自交系，属于玉米lancaster种质，非reid群，株高正常，约170cm，自交系mo17的基因组已经测序。

玉米矮秆材料dnt06(父本)，株高矮化，约100cm，花粉育性正常。矮秆材料dnt06的矮秆性状在多个年份、多个地点(扬州、三亚、北京)进行了鉴定，矮秆性状表现稳定，不受年份与环境的影响。

本发明实施案例利用这两个亲本配置f1，f1后代与矮秆材料dnt06回交产生bc1代。然后在回交后代群体中，选择株高正常的植株作为母本，矮秆材料dnt06作为父本，连续回交多个世代，获得高世代回交群体bc6。

二、玉米株高基因的初步定位

1、玉米基因组dna的提取

使用改良的sds法提取亲本及分离群体bc、f2的基因组dna。

2、snp芯片检测亲本、混池、分离群体单株基因型

采用玉米55ksnp芯片、集团分离分析bsa的方法，对亲本、混池、分离群体单株dna进行基因型检测。玉米55ksnp芯片的开发：从广泛应用的56ksnp芯片(maizesnp50)中挑选出20ksnp标记；从欧洲600k玉米芯片(600kaxionmaizegenotypingarray)挑选出在基因组上均匀分布的10ksnp标记；从全基因组rna-seq数据挑选出10ksnp标记；从大规模dna重测序和rna-seq数据中筛选出热带特有的15ksnp标记。

3、玉米株高基因初步定位

根据双亲、后代分离群体基因型检测、表型鉴定的结果，对玉米株高相关基因进行初步定位。将基因定位于snp标记ax-91828920和snp标记ax-91830391之间，两者均位于玉米第10号染色体。

4、indel、ssr分子标记的开发及多态性标记筛选

基于基因初步定位的结果，在初定位snp分子标记ax-91828920和ax-91830391之间，根据maizegdb，获得16对ssr引物，将基因定位于分子标记umc2350(图1)和umc1697之间(图2)；亲本mo17的基因组序列已经测定，通过比较亲本mo17和玉米参考基因组b73的序列，在初定位分子标记umc2350和umc1697之间，共设计了238对ssr引物。引物设计原则：长度18-22bp，目标条带长度150-200bp。pcr扩增体系：0.5μldna模板，1μl10×pcrbuffer(含mg²⁺)，0.2mmdntps，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，0.5utaq酶，加ddh2o至10μl。pcr反应循环：94℃预变性1min；94℃变性30s，55-58℃(根据引物的tm值微调)退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，15℃保存。使用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，ssr引物ssrs1、ssr229、ssr-z60在亲本间具有多态。亲本间有多态性的引物ssr51、ssr229、ssr-z60检测分离群体中的高秆、矮秆单株，进行验证，结果在分离群体单株中呈现与亲本检测一致的差异条带(图3，图4)。根据上述定位的结果设计14对indel标记，1对标记indel6、indel12在亲本间具有多态(图5)。

三、玉米株高基因的精细定位

利用上述多态性ssr、indel标记检测bc群体，分析bc群体的基因型，结合表型数据，最终将玉米株高基因精细定位到分子标记indel6和ssr229之间，物理距离约148kb。玉米株高基因精细定位的结果，为后续株高基因的克隆奠定了基础。

实施例2

应用株高紧密连锁indel6和ssr229标记检测多份高秆、矮秆材料

(1)选取58份高秆材料、62份矮秆材料。

(2)分别提取120份材料基因组dna，使用indel6和ssr229标记进行pcr扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。indel6在58份高秆材料、62份矮秆材料的结果，基因型与表现型一致(如图6)。ssr229在58份高秆材料、62份矮秆材料的结果，基因型与表现型一致(如图7)。

(3)上述两个indel6和ssr229标记可以将高秆材料与矮秆材料区分开。