一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法与流程

本发明属于植物精油提取技术领域，具体提供一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法。

背景技术：

茶树精油，是从山茶科茶属（camelliasinensis）植物的叶片和嫩梢为原料提取的一类物质，具有杀菌消炎、收敛毛孔、调节人体免疫力等作用。而目前市售大部分号称“澳洲茶树精油”的物质，是从互叶白千层（melaleucaahemifolia）的一类植物中提取的，其成分和效果与山茶科茶属提炼的茶树精油不相同。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法。本发明利用山茶科茶属植物，也就是传统意义上的茶树栽培种的鲜叶和嫩稍为原料，进行提取，得到具有抑制肝癌细胞增殖效果的一种精油。该产品具有良好的保健功效。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法，包括以下步骤：

（1）采集山茶科茶属植物叶片和嫩梢，置于冷冻干燥集中，以-25至-50℃冷冻干燥，将得到的冷冻干燥型干茶样品用粉碎机粉碎，过40-100目筛，得到粉碎后干茶样品。

（2）将粉碎后干茶样品放置于500ml锥形瓶中，按照每1g粉碎干茶样品加入10g的石油醚比例，加入石油醚。

（3）在25-40℃的水浴摇床中萃取24-72h。取出锥形瓶，分装于离心管中，离心条件为：4-10℃，8000-10000rpm，离心10-15min。

（4）将离心后的滤液抽滤，放置于10ml圆底烧瓶，真空浓缩，条件：水温37-40℃，真空度100-200mpa。

（5）随后用无水乙醇溶解茶树精油固体，得到茶树精油。

本发明的显著优点在于：提取率较高，所得茶树精油纯度高，最大限度地提取了山茶科植物芽叶中的有效成分，利用效率较高，含水率较低，有利于保存，且无有毒有害溶剂残留，工艺简单，使用设备少，适宜大量生产，提取所得制品有良好的生物学活性，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1加入本发明实施例1精油后肝癌细胞的存活率；

图2加入本发明实施例1精油后肝癌细胞的膜电位变化。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法，包括以下步骤：

（1）采集山茶科茶属植物叶片和嫩梢，置于冷冻干燥集中，以-20℃冷冻干燥，将得到的冷冻干燥型干茶样品用粉碎机粉碎，过100目筛，得到粉碎后干茶样品。

（2）将粉碎后干茶样品放置于500ml锥形瓶中，按照每1g粉碎干茶样品加入10g的石油醚比例，加入石油醚。

（3）在40℃的水浴摇床中萃取72h。取出锥形瓶，分装于离心管中，离心条件为：5℃，10000rpm，离心15min。

（4）将离心后的滤液抽滤，放置于10ml圆底烧瓶，真空浓缩，条件：水温40℃，真空度150mpa。

（5）随后用无水乙醇溶解茶树精油固体，得到茶树精油。用该方法所得茶树精油提取率为1%。

实施例2

一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法，包括以下步骤：

（1）采集山茶科茶属植物叶片和嫩梢，置于冷冻干燥集中，以-50℃冷冻干燥，将得到的冷冻干燥型干茶样品用粉碎机粉碎，过80目筛，得到粉碎后干茶样品。

（2）将粉碎后干茶样品放置于500ml锥形瓶中，按照每1g粉碎干茶样品加入10g的石油醚比例，加入石油醚。

（3）在35℃的水浴摇床中萃取72h。取出锥形瓶，分装于离心管中，离心条件为：4℃，10000rpm，离心15min。

（4）将离心后的滤液抽滤，放置于10ml圆底烧瓶，真空浓缩，条件：水温35℃，真空度100mpa。

（5）随后用无水乙醇溶解茶树精油固体，得到茶树精油。用该方法所得茶树精油提取率在1-1.2%。

实施例3

一种具有抑制癌细胞增殖效果的茶树精油制备方法，包括以下步骤：

（1）采集山茶科茶属植物叶片和嫩梢，置于冷冻干燥集中，以-35℃冷冻干燥，将得到的冷冻干燥型干茶样品用粉碎机粉碎，过60目筛，得到粉碎后干茶样品。

（2）将粉碎后干茶样品放置于500ml锥形瓶中，按照每1g粉碎干茶样品加入10g的石油醚比例，加入石油醚。

（3）在35℃的水浴摇床中萃取48h。取出锥形瓶，分装于离心管中，离心条件为：6℃，10000rpm，离心12min。

（4）将离心后的滤液抽滤，放置于10ml圆底烧瓶，真空浓缩，条件：水温40℃，真空度200mpa。

（5）随后用无水乙醇溶解茶树精油固体，得到茶树精油。用该方法所得茶树精油提取率为0.8-0.9%。

抑制肝癌细胞（hepg-2）增殖实验

将预制好的茶树精油按1/25，1/50，1/100，1/200，1/400等体积比例稀释。将hepg-2细胞培养至对数生长期，胰酶消化，接种于96孔板（每孔200μl），于培养箱，37℃，5%co2培养，待其融合度达到70-80%后，吸除培养液，每孔加100μl相应培养基配制的不同等比浓度的本发明茶树精油溶液，继续培养24h，然后每孔添加20μl的mtt溶液（5mg/ml）后继续孵育4h，去除培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，震荡5min，与490nm波长处测定样品吸光度，为防止样品本身影响，将相应培养基设置为调零孔，并以样品溶剂代替样品作为对照。

由图1可知，与正常培养肝癌细胞相比，加入不同稀释比例的精油后，肝癌细胞的存活率明显降低，存活率均在60%以下，说明茶树精油对肝癌细胞增殖产生明显的抑制作用。

细胞膜jc-1实验

jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential)的荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过jc-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用jc-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。将预制好的茶树精油按1/25，1/50，1/100，1/200，1/400体积等比稀释将细胞培养至对数生长期，胰酶消化，接种于96孔板（每孔200μl），于co2培养箱培养，加入等比稀释茶树精油溶液100μl，24h后吸除培养液，加入细胞培养液50μl和jc-1染色液50μl，充分混匀。细胞培养箱中孵育20min。孵育结束后，吸除上清，用jc-1buffer(1×)洗涤2次。加入100μl细胞培养液，使用荧光酶标仪检测。检测jc-1单体时设置激发光490nm，发射光设置530nm；检测jc-1聚合体时，设置激发光525nm，发射光设置590nm。

由图2可知，与正常培养肝癌细胞相比，加入不同稀释比例的精油后，肝癌细胞的细胞膜电位显著下降，并且随着所用精油浓度增高，膜电位呈现负相关关系，说明加入精油后，可以对肝癌细胞的细胞膜产生影响，诱导细胞凋亡，从而抑制肝癌细胞的增殖。