本发明属于生物催化药物合成领域，提供了一种采用介孔二氧化硅固定化酶催化剂高效催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4h-吡喃药物中间体的方法。
背景技术：
酶作为一种高效的生物催化剂，具有高效性、强专一性等特点，许多难以进行的有机反应在酶的催化下都能顺利完成。然而，对于非专一性底物，酶催化往往无法实现其高效转化。因此，如何调控酶结构强化其对非专一底物的催化转化是近些年来生物化学以及催化化学等领域的研究热点。
目前调控酶结构的方法有定点突变和固定化，定点突变对酶的一级结构即氨基酸序列进行调控，固定化则调控酶的二级、三级或四级结构。固定化调控酶的结构主要有调控酶的微环境、界面活化、以及酶活性中心相对位置三个方面。
首先调控酶的微环境方面，guisan等采用不同的方法，利用界面吸附分别将皱褶假丝酵母脂肪酶固载在疏水性辛基改性的琼脂糖载体上、离子吸附在pei涂覆的琼脂糖载体上、共价固定在戊二醛活化的琼脂糖载体上，为酶构筑不同的表面微环境，应用于催化转化不对称反应扁桃酸甲酯的水解中，发现不同方法固定化酶的催化性能(活性、特异性和对映选择性)显著不同。其中在辛基改性的琼脂糖载体上得到s异构体，而戊二醛衍生载体组装酶得到了r异构体，对映选择性e为400。而聚乙烯亚胺(pei)衍生的载体得到s异构体，对映选择性和活性都很低。文章推断不同载体与酶的作用位点不同，导致酶活性中心的构象以及底物结合的取向不同，因此可得到不同构型的产物。因此，使用不同衍生物改性的载体，有可能获得不同构型的对映体。
在界面活化方面，li等将来自洋葱假单胞菌的脂肪酶(pcl)固载在亲疏水性不同的表面上，催化外消旋体1-苯基乙醇的转酯化反应，载体mcf全称表面分别采用疏水烷基丙基、辛基、和苯环进行改性，利用色氨酸(trp)的内源荧光性质表征固定化酶周围的疏水性。结果表明疏水性越强，盖子打开的程度越大，活性越高。
利用固定化调控酶的活性中心相对位置的报道目前还没有发现。
4h-吡喃类化合物，结构简单且具有重要的生物活性，如抗微生物，抗病毒，抗惊厥，不具有细胞毒性和抗原毒素，也可用于治疗阿尔茨海默病，精神分裂症和肌阵挛病，因此，其高效合成引起了科学工作者的广泛关注。本发明选取苯亚甲基丙二腈衍生物和2,4-戊二酮的c-c加成反应制备4h-吡喃类药物中间体。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效的生物催化剂，可以高效催化非专一性底物苯亚甲基丙二腈衍生物二腈转化为4h-吡喃类药物中间体。
一种固定化酶生物催化剂，其特征在于，由催化剂活性中心及介孔二氧化硅载体通过界面组装而成，催化剂活性中心组装到介孔二氧化硅的表面孔中，催化剂活性中心为脂肪酶，优选催化剂酶活性中心固载在载体表面的密度为0-20mg/m2载体表面，不为0；
进一步优选以不同孔径的介孔二氧化硅(sba-15、sba-16、mcf)为载体使得二氧化硅和催化剂活性中心协同匹配实现提高催化非专一性底物苯亚甲基丙二腈衍生物二腈转化为4h-吡喃类药物中间体的催化性能。一般sba-15、sba-16、mcf的介孔范围为8-11nm。
本发明固定化酶生物催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备复合介孔大小要求的介孔二氧化硅载体；
(2)将介孔二氧化硅载体加入到初始浓度为1-40mg/ml、ph为5-8的酶溶液，在摇床上摇晃进行组装，离心除去上清液，放入冷冻干燥箱干燥5h后取出，得到固定化酶生物催化剂。
进一步一定孔径结构的sba-15、sba-16、mcf的制备如下：
一定孔径结构的sba-15的制备包括以下步骤：每64ml去离子水和8.2ml12mol·ml-1浓盐酸混合，缓慢搅拌的条件下加入2g切块的嵌段共聚物p123并持续搅拌，待p123完全溶解后升高温度到45℃，在剧烈搅拌条件下缓慢滴加4.4310g(0.0213mol)正硅酸乙酯，保持滴加速度20滴/min，滴加结束后继续搅拌反应24h；将溶液转移到反应釜内，置于140℃条件下晶化48h；晶化结束后自然冷却至室温，抽滤分离，首先用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，室温干燥后得到白色固体粉末。最后将得到的固体在程序升温马弗炉550℃条件下高温煅烧6h去除模板剂，升温速率5℃/min，得到介孔材料sba-15。
一定孔径结构的sba-16的制备包括以下步骤：室温下每1g三嵌段共聚物f127加入到100ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，依次添加38ml去离子水和1.38ml37％的浓盐酸(12mol·l-1)，慢慢搅拌使f127完全溶解后，升高温度到40℃，在剧烈搅拌条件中缓慢滴加4.2000g(0.0202mol)正硅酸乙酯，保持滴加速度20滴/min；滴加结束后，搅拌24h，然后将反应釜置于100℃条件下晶化24h；晶化结束后将反应混合物自然冷却至室温，抽滤分离，首先用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，室温干燥12h后得到白色固体粉末。最后将得到的固体在550℃条件下用程序升温马弗炉高温煅烧6h去除模板剂，得到sba-16。
一定孔径结构的mcf的制备包括以下步骤：每4.0003gp123，加入到65ml去离子水和10ml37％浓盐酸的混合液中，缓慢搅拌至完全溶解，升高温度至40℃，在剧烈搅拌条件中逐滴加入1,3,5-三甲基苯(tmb)，保持滴加速度20滴/min；分别控制tmb/p123质量比为0.1-0.75，搅拌120min，再缓慢滴加入8.5900g(0.0412mol)正硅酸乙酯，同样保持滴加速度20滴/min，混合均匀后恒温静置24h；然后加入5ml溶解46.0020mg(0.0012mol)的nh4f水溶液，快速搅拌后置于反应釜内100℃条件下晶化反应24h，晶化结束后冷却至室温，抽滤分离，首先用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，室温干燥后得到白色固体粉末。最后将得到的固体在550℃条件下高温煅烧6h去除模板剂，得到mcf。
本发明固定化酶生物催化剂的应用，用于苯亚甲基丙二腈衍生物和2,4-戊二酮的c-c加成反应制备4h-吡喃类药物中间体。
苯亚甲基丙二腈衍生物和2,4-戊二酮的c-c加成反应制备4h-吡喃类药物中间体的方法，其特征在于，以非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈为底物，采用上述所述的固定化酶生物催化剂作为催化剂，与2,4-戊二酮的c-c在有机溶剂中加成反应制备4h-吡喃类药物中间体，反应温度10-40℃，反应时间0-36h。
本发明具有如下优点：
1.本发明催化剂中心由黑曲霉脂肪酶(anl)，无机载体sba-15、sba-16、mcf组成。利用介孔二氧化硅孔道形状和孔道尺寸可调的性质，控制了催化剂载体微环境的结构。利用无机载体表面性质和酶的物理相互作用进行组装，制备固定化生物催化剂。催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈转化为4h-吡喃类药物中间体，与游离酶(活性64.2u/g)相比，得到高达246.9u/g的活性，能够高效催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈转化制备4h-吡喃类药物中间体。
2.该催化剂反应条件催化反应条件还是合成反应条件温和，能耗低。最优条件反应在30℃、常压，催化剂重复使用性能好，重复使用性研究表明使用5次后mcf-23-anl仍然能保持72％的初始活性，特别是前三次，保持91％的初始活性。
3.本发明的生物催化剂制备方法简单，成本较低，有利于应用在工业生产的过程中。
4.sba-15，sba-16，mcf系列介孔二氧化硅包含直型孔道及三维笼型孔道，孔径范围在8-31nm之间，本发明采用8-11nm之间纸件的孔径能更好的使得二氧化硅和催化剂活性中心协同匹配实现提高催化非专一性底物苯亚甲基丙二腈衍生物二腈转化为4h-吡喃类药物中间体的催化性能提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
步骤a：
在烧杯中加入64ml去离子水和8.2ml12mol·ml-1浓盐酸，缓慢搅拌的条件下加入2.0000g切块的嵌段共聚物p123并持续搅拌，待p123完全溶解后升高温度到45℃，在剧烈搅拌条件下缓慢滴加4.4310g(0.0213mol)正硅酸乙酯，保持滴加速度20滴/min，滴加结束后继续搅拌反应24h。将溶液转移到反应釜内，置于140℃条件下晶化48h。晶化结束后自然冷却至室温，抽滤分离，首先用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，室温干燥后得到白色固体粉末。最后将得到的固体在程序升温马弗炉550℃条件下高温煅烧6h去除模板剂，升温速率5℃/min，得到介孔材料sba-15。孔径为11nm。
步骤b：称取1.0g的sba-15放于锥形瓶中，加入初始浓度为1-40mg/ml、ph为5-8的酶溶液，在摇床上摇晃24h，离心除去上清液，放入冷冻干燥箱干燥5h后取出，得到sba-15组装酶。
步骤c：准确称取0.1mmol(0.0172g)底物对氟苯亚甲基丙二腈和0.15mmol(0.0150g)2,4-戊二酮加入反应瓶中，加入6mg固载酶催化剂、1ml乙醇，在30℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后，离心除去催化剂，催化剂用2ml乙醇洗涤三次，收集上清液，真空旋蒸除去溶剂，利用柱层析分离纯化产物，层析液为正己烷和乙酸乙酯，比例为正己烷:乙酸乙酯＝5:1。分离后得到白色固体产物，确定产物结构。催化剂过滤分离出来后，低温干燥以备循环使用。采用本固载酶催化剂时底物对氟苯亚甲基丙二腈的转化率为55％，活性174.6u/g。
实施例2
步骤a：室温下准确称取1.0000g三嵌段共聚物f127加入到100ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，依次添加38ml去离子水和1.38ml37％的浓盐酸(12mol·l-1)，慢慢搅拌使f127完全溶解后，升高温度到40℃，在剧烈搅拌条件中缓慢滴加4.2000g(0.0202mol)正硅酸乙酯，保持滴加速度20滴/min。滴加结束后，搅拌24h，然后将反应釜置于100℃条件下晶化24h。晶化结束后将反应混合物自然冷却至室温，抽滤分离，首先用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，室温干燥12h后得到白色固体粉末。最后将得到的固体在550℃条件下用程序升温马弗炉高温煅烧6h去除模板剂，得到sba-16，孔径为8nm。
步骤b：称取1.0g的sba-16放于锥形瓶中，加入初始浓度为1-40mg/ml、ph为5-8的酶溶液，在摇床上摇晃24h，离心除去上清液，放入冷冻干燥箱干燥5h后取出，得到sba-16组装酶。
步骤c：准确称取0.1mmol(0.0172g)底物对氟苯亚甲基丙二腈和0.15mmol(0.0150g)2,4-戊二酮加入反应瓶中，加入6mg固载酶催化剂、1ml乙醇，在30℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后，离心除去催化剂，催化剂用2ml乙醇洗涤三次，收集上清液，真空旋蒸除去溶剂，利用柱层析分离纯化产物，层析液为正己烷和乙酸乙酯，比例为正己烷:乙酸乙酯＝5:1。分离后得到白色固体产物，确定产物结构。催化剂过滤分离出来后，低温干燥以备循环使用。采用本固载酶催化剂时底物对氟苯亚甲基丙二腈的转化率为64％，活性185.1u/g。
实施例3
步骤a：准确称取4.0003gp123，加入到65ml去离子水和10ml37％浓盐酸的混合液中，缓慢搅拌至完全溶解，升高温度至40℃，在剧烈搅拌条件中逐滴加入1,3,5-三甲基苯(tmb)，保持滴加速度20滴/min。分别控制tmb/p123质量比为0.1、0.3、0.75，搅拌120min，再缓慢滴加入8.5900g(0.0412mol)正硅酸乙酯，同样保持滴加速度20滴/min，混合均匀后恒温静置24h。然后加入5ml溶解46.0020mg(0.0012mol)的nh4f水溶液，快速搅拌后置于反应釜内100℃条件下晶化反应24h，晶化结束后冷却至室温，抽滤分离，首先用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，室温干燥后得到白色固体粉末。最后将得到的固体在550℃条件下高温煅烧6h去除模板剂，得到mcf，孔径为11nm。
步骤b：称取1.0g的mcf放于锥形瓶中，加入初始浓度为1-40mg/ml、ph为5-8的酶溶液，在摇床上摇晃24h，离心除去上清液，放入冷冻干燥箱干燥5h后取出，得到mcf组装酶。
步骤c：准确称取0.1mmol(0.0172g)底物对氟苯亚甲基丙二腈和0.15mmol(0.0150g)2,4-戊二酮加入反应瓶中，加入6mg固载酶催化剂、1ml乙醇，在30℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后，离心除去催化剂，催化剂用2ml乙醇洗涤三次，收集上清液，真空旋蒸除去溶剂，利用柱层析分离纯化产物，层析液为正己烷和乙酸乙酯，比例为正己烷:乙酸乙酯＝5:1。分离后得到白色固体产物，确定产物结构。催化剂过滤分离出来后，低温干燥以备循环使用。采用本固载酶催化剂时底物对氟苯亚甲基丙二腈的转化率为96％，活性246.9u/g。
实施例4
将催化剂mcf组装酶的底物应用范围进一步扩展为(4-硝基苯亚甲基)丙二腈，(4-氯苯亚甲基)丙二腈，(4-羟基苯亚甲基)丙二腈，苯亚甲基丙二腈，分别和底物2,4-戊二酮进行反应，得到相应的产物。取代基为吸电子基no2和cl时，分别得到221.6u·g-1、243.0u·g-1，取代基为h时，得到247.8u·g-1的活性，而对于给电子取代基oh，得到80.12u·g-1的活性。因此，固载催化剂mcf组装酶对带有吸电子基团的底物具有较好的反应活性，随着吸电子效应减弱，活性升高，但是对于给电子基-oh基团官能化的底物，活性最低。固载催化剂mcf组装酶具有较好的普适性。
实施例5(即对比例)
准确称取0.1mmol底物(4-氟苯亚甲基)和0.15mmol4-戊二酮加入反应瓶中，加入0.3mg游离酶anl、1ml乙醇，在30℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后，离心除去催化剂，催化剂用2ml乙醇洗涤三次，收集上清液，真空旋蒸除去溶剂，利用柱层析分离纯化产物，采用游离酶催化剂时底物对氟苯亚甲基丙二腈的转化率为20％，活性64.9u/g。