一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法与流程

本发明涉及一种干细胞的分离、扩增方法，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，属于生物技术领域。

背景技术：

间充质干细胞具有自我复制，多向分化和免疫调节的生物学特性，已经成为研究热点。骨髓来源的间充质干细胞研究虽多，但其采样势必通过创伤性获得，并且随着个体的成长，其质量和数量有所下降。目前，国内外研究人员已经能够从脐带，脐血，牙髓中获得间充质干细胞，但获得的细胞数量有限。寻求一种高效分离间充质的方法，且组织来源方便，不受伦理道德约束，是必然的发展趋势。胎盘组织作为再生医学最有价值的细胞来源，且不受伦理道德约束。羊膜比胎盘具有更丰富的间充质干细胞，已成为各研究者青睐的对象。

羊膜组织结构复杂，包括上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层，而羊膜间充质干细胞位于羊膜的最内层。目前羊膜间充质干细胞的分离方法种类繁多，且或得的细胞纯度及活性结果不一。

本研究通过两步酶消化法，首先用胰蛋白酶和edta去除羊膜上皮干细胞，再用胶原酶ⅰ和dnaseⅰ，消化分离获得羊膜间充质干细胞。

目前，分离羊膜间充质干细胞的方法主要是酶解法。羊膜组织结构复杂，单纯的酶解并不能将羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的分开，很难获得高纯度的间充质干细胞系；其次也有使用细胞刮刀去除羊膜上皮细胞后，再进行羊膜间充质干细胞的分离，这种方法容易造成污染，并且分离羊膜上皮细胞也不彻底；还有利用组织分离器，获得羊膜组织匀浆，再进行酶消化，操作相对繁琐，并且成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，其特征在于，包括：

一、试剂

二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞

三、羊膜间充质干细胞传代培养。

进一步，一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，包括：

一、试剂

1.胎盘保存液及清洗液

注射用青霉素和硫酸链霉素用注射用生理盐水配置成每毫升1万单位的储存液，即为1％的双抗储存液；

500ml的注射用生理盐水加入5ml的双抗储存液，再加入2ml注射用硫酸庆大霉素，即配置成胎盘保存液或清洗液；

2.胰蛋白酶储存液

称取0.5g的胰蛋白酶，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.5％(m/v)的胰蛋白酶储存液；

3.edta储存液

称取0.2gedta二钠，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的edta储存液；

4.胶原酶ⅰ储存液

称取1g胶原酶ⅰ，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为1％(m/v)的胶原酶ⅰ储存液；

5.dnaseⅰ储存液

称取0.2gdnaseⅰ，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的dnaseⅰ储存液；

6.培养基及原代培养基

培养基为lonza通用型无血清培养基，按使用说明添加血清替代品及l-谷氨酰胺。原代培养基每50ml添加1％的双抗储存液500μl，添加200μl的注射用硫酸庆大霉素；

二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞

1.胎盘运输

孕妇分娩后的胎盘(须经产妇本人同意)，置于含有保存液的胎盘储存盒中，2～8摄氏度及时运送回实验室。样本接收室检查运输温度，胎盘盒是否完整，避免出现污染，并对其进行编号；

2.羊膜分离组织分离

将胎盘置于不锈钢托盘中，用清洗液清洗1次；用手将围绕脐带周围胎盘子面的羊膜撕下，放入培养皿中，用手术剪将带有血渍的边缘剪掉，加入75％的医用酒精进行漂洗，再放入新的培养皿中，加入清洗液清洗，并用组织剪剪成1×1cm²大小的组织块，再用清洗液清洗一遍，转移至50ml离心管中，每管含羊膜组织10ml，1300rpm/min离心5min；

3.羊膜上皮细胞分离

离心结束后，弃上清，每管加入胰蛋白酶储存液3ml，edta储存液3ml，补充生理盐水至30ml，此时胰蛋白酶的浓度和edta的浓度分别为0.05％和0.02％。145rpm/min，37℃振荡消化15min；

消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清。再重复上述胰蛋白酶和edta消化的步骤；

4.羊膜间充质干细胞分离

上述消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清。将羊膜组织放入培养皿中，用清洗液清洗两次；

将羊膜组织放入新的50ml离心管中，每管约含组织10ml，并剪碎羊膜组织1-3mm；加入胶原酶ⅰ2ml，dnaseⅰ2ml，补充生理盐水至20ml，此时胶原酶ⅰ和dnaseⅰ的浓度分别为0.1％和0.02％。145rpm/min，37℃振荡消化60min；

消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清及组织。每管加入10ml原代培养基接种于10cm的培养皿中培养；

5.原代换液

培养至第3天，进行第一次半换液，第6天根据实际情况进行半换或全换液，以后每隔3天全换液；

三、羊膜间充质干细胞传代培养

观察原代细胞融合度60％以上即可传p1代，接种密度为8000～10000个/cm²；以后细胞融合度达80％以上即可传代。传代为完全培养基，无需添加双抗或庆大霉素。

本发明的有益效果：

本发明研究的方法，与现有的羊膜间充质干细胞分离方法相比，使用两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，第一步去除羊膜上皮细胞，且消化两次，使羊膜上皮细胞去除的更充分，获得的羊膜间充质干细胞纯度更高，并且操作简单，无需组织及细胞过滤，使用dnaseⅰ避免羊膜间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离，获得的干细胞数量更多。整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。

附图说明

图1为本发明的流式检测图。

图2为本发明原代，p1，p2，p3各代次的培养图片。注：左上原代第15天，右上p1第3天，左下p2第3天，右下p3第3天。

附图标记：

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1

一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增方法，

一、试剂

1.胎盘保存液及清洗液

注射用青霉素和硫酸链霉素用注射用生理盐水配置成每毫升1万单位的储存液，即为1％的双抗储存液。500ml的注射用生理盐水加入5ml的双抗储存液，再加入2ml注射用硫酸庆大霉素，即配置成胎盘保存液或清洗液；

2.胰蛋白酶储存液

称取0.5g的胰蛋白酶，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.5％(m/v)的胰蛋白酶储存液；

3.edta储存液

称取0.2gedta二钠，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的edta储存液；

4.胶原酶ⅰ储存液

称取1g胶原酶ⅰ，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为1％(m/v)的胶原酶ⅰ储存液；

5.dnaseⅰ储存液

称取0.2gdnaseⅰ，溶解于100ml生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为0.2％(m/v)的dnaseⅰ储存液；

6.培养基及原代培养基

培养基为lonza通用型无血清培养基，按使用说明添加血清替代品及l-谷氨酰胺。原代培养基每50ml添加1％的双抗储存液500μl，添加200μl的注射用硫酸庆大霉素；

二、两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞

1.胎盘运输

孕妇分娩后的胎盘(须经产妇本人同意)，置于含有保存液的胎盘储存盒中，2～8摄氏度及时运送回实验室。样本接收室检查运输温度，胎盘盒是否完整，避免出现污染，并对其进行编号。

2.羊膜分离组织分离

将胎盘置于不锈钢托盘中，用清洗液清洗1次；用手将围绕脐带周围胎盘子面的羊膜撕下，放入培养皿中，用手术剪将带有血渍的边缘剪掉，加入75％的医用酒精进行漂洗，再放入新的培养皿中，加入清洗液清洗，并用组织剪剪成1×1cm²大小的组织块，再用清洗液清洗一遍，转移至50ml离心管中，每管含羊膜组织10ml，1300rpm/min离心5min；

3.羊膜上皮细胞分离

离心结束后，弃上清，每管加入胰蛋白酶储存液3ml，edta储存液3ml，补充生理盐水至30ml，此时胰蛋白酶的浓度和edta的浓度分别为0.05％和0.02％。145rpm/min，37℃振荡消化15min。消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清。再重复上述胰蛋白酶和edta消化的步骤；

4.羊膜间充质干细胞分离

上述消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清。将羊膜组织放入培养皿中，用清洗液清洗两次。将羊膜组织放入新的50ml离心管中，每管约含组织10ml，并剪碎羊膜组织1-3mm。加入胶原酶ⅰ2ml，dnaseⅰ2ml，补充生理盐水至20ml，此时胶原酶ⅰ和dnaseⅰ的浓度分别为0.1％和0.02％。145rpm/min，37℃振荡消化60min。消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min离心5min；弃上清及组织。每管加入10ml原代培养基接种于10cm的培养皿中培养；

5.原代换液

培养至第3天，进行第一次半换液，第6天根据实际情况进行半换或全换液，以后每隔3天全换液；

三、羊膜间充质干细胞传代培养

观察原代细胞融合度60％以上即可传p1代，接种密度为8000～10000个/cm²。以后细胞融合度达80％以上即可传代。传代为完全培养基，无需添加双抗或庆大霉素。p3代取细胞量1.0～1.2×10⁶cell/ml进行细胞表面标志物检测。

流式检测羊膜间充质干细胞表面标志物

1)取单细胞悬液，1200rpm/min，离心5min；

2)用pbs重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1.0～1.2×10⁶cell/ml；

3)加抗体cd90、cd105、cd166，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30min，同时设置同型对照；

4)加1mlpbs于流式检测管中，1200rpm，5min，弃上清；

5)加100ulpbs,轻轻吹打混匀，上机检测。

结果：羊膜间充质干细胞三种表面标志物cd90-95.13％、cd105-96.99％、cd166-98.47％，阳性率均在95％以上，图1为本发明的流式检测图，如图1所示。

原代培养第15天细胞融合度80％以上，如图2左上所示，p1代第3天如图2右上所示，p2代第3天如图2左下所示，p3代第3天如图2右下所示。

本研究的方法，与现有的羊膜间充质干细胞分离方法相比，使用两步酶消化法分离羊膜间充质干细胞，第一步去除羊膜上皮细胞，且消化两次，使羊膜上皮细胞去除的更充分，获得的羊膜间充质干细胞纯度更高，并且操作简单，无需组织及细胞过滤，使用dnaseⅰ避免羊膜间充质干细胞进入消化粘液中而无法分离，获得的干细胞数量更多。整个分离过程无动物源性成分，安全性好，便于后续的研究应用。

以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。