一种从梅片树叶片中提取天然右旋龙脑的预处理方法与流程

本发明属于生物制药技术领域，更具体地，涉及一种从梅片树叶片中提取天然右旋龙脑的预处理方法。

背景技术：

天然右旋龙脑是从樟科植物龙脑香中提取的一种珍贵药材和名贵香料，有抗癌治癌、抗菌消炎、消肿止痛、祛风醒神、开窍解毒等作用，广泛应用于医药、食品、化妆品和香料工业上，我国主要依赖于进口。近年由于原产地马来西亚龙脑香的乱砍乱伐，资源植物几近耗竭，因此天然右旋龙脑价格很高，开发使用其他资源植物提取天然右旋龙脑，缓解国家该原料药的紧俏局势迫在眉睫。广东省梅州地区发现的梅片树是樟科植物阴香(cinnammoniaburmannii)的一个富含天然右旋龙脑化学型，是天然右旋龙脑良好的资源植物。采用水蒸气蒸馏法或索氏提取的方法，可以从梅片树叶中提取天然右旋龙脑，如何改善提取方法，提高提取效率，充分利用有限资源，生产更多产品，成为制约天然右旋龙脑相关产业可持续发展的关键技术。现有技术提取的效率不够高，水蒸气蒸馏法的最高提取效率大约1.3mg/g，索氏提取(乙醇浸提)的提取效率约2mg/g。提取得不彻底，造成资源浪费。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明提供了一种从梅片树叶片中提取天然右旋龙脑的预处理方法。经该法采用深度共熔溶剂预处理梅片树叶片，能显著提高梅片树叶片提取天然右旋龙脑的提取效率。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种从梅片树叶片中提取天然右旋龙脑的预处理方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

s1.将梅片树叶片经过深度共熔溶剂预处理，所述深度共熔溶剂包括氢键受体和氢键供体；

s2.将混合物经离心处理分离固体颗粒并用清水冲洗，采用索氏提取法用无水乙醇循环提取至提取液体的颜色不再变化，提取液过滤后采用气相色谱法测定右旋龙脑的含量。

优选地，步骤s1中所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为三甘醇、甘油、乙二醇、草酸、柠檬酸、乳酸、尿素或乙酰胺；当所述氢键供体为葡萄糖、果糖、麦芽糖或蔗糖时，所述深度共熔溶剂还包括水。

更为优选地，所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为蔗糖。

优选地，步骤s1中所述梅片树叶片的质量和深度共熔溶剂的体积比为(0.5～1.5)g：(30～80)ml，所述氢键受体和氢键供体的摩尔比为1：(1～4)；所述氢键受体、氢键供体和水的摩尔比为5:2:(2～18)。

更为优选地，所述梅片树叶片的质量和深度共熔溶剂的体积比为1g：50ml；所述氢键受体、氢键供体和水的摩尔比为5:2:5.9。

优选地，步骤s1中所述预处理的温度为30～50℃，预处理的搅拌速率为200～400rpm，预处理的搅拌时间为2～10h。

更为优选地，所述预处理的温度为44.5℃，预处理的搅拌速率为300rpm，预处理的搅拌时间为4.07h。

优选地，步骤s2中所述离心的速率范围为20000～35000rpm，所述离心的时间范围为5～15min。

更为优选地，所述离心的速率为25000rpm，所述离心的时间为10min。

优选地，步骤s2中所述冲洗的时间为2～10min。

本发明中的深度共熔溶剂是由一定物质量比的氢键供体和氢键受体结合而成的低共熔混合物，其凝固点比各个组分纯物质的熔点都要低，理化性质与离子液体非常相似，因而也被当做一种新型的离子液体。深度共熔溶剂不仅具有与离子液体类似的沸点高、熔点低、易回收等优点，且成本较低，合成简单。深度共熔溶剂中氢键供体和受体与细胞壁中的木质素或纤维素相互作用，促进了细胞结构中木质素和纤维素结构的松动。因此，深度共熔溶剂预处理后细胞壁结构疏松，细胞内物质易于提取。

天然右旋龙脑主要来源于富含天然右旋龙脑的植物中提取生产。梅片树属于樟科樟属植物阴香的一个化学型，其茎、叶等器官中均含有丰富的右旋龙脑资源，是天然右旋龙脑良好的资源植物。本发明采用基于氯化胆碱的多种深度共熔溶剂预处理梅片树叶，之后再用索氏提取法提取天然右旋龙脑，发现大部分经过预处理的叶片右旋龙脑的提取效率都要显著高于未经过预处理的叶片，其中氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为乙二醇、乳酸、麦芽糖或蔗糖时，提取效率较高，且与其他(甘油除外)提取效率有显著差异。接着对氯化胆碱和蔗糖合成的深度共熔溶剂预处理的条件进行了优化。用bbd响应面法对深度共熔溶剂含水量、预处理温度和时间进行分析出最佳的预处理条件为：采用氯化胆碱、蔗糖、水按照5:2:5.9的摩尔比合成的深度共熔溶剂，在44.5℃的温度下，预处理4.07h梅片树叶之后进行提取的效率最高(4.936mg/g)。研究说明该预处理工艺能有效提高右旋龙脑的提取率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用深度共熔溶剂预处理梅片树叶片，能显著提高梅片树叶片提取天然右旋龙脑的提取效率。提取右旋龙脑的提取效率能够达到4.936mg/g，显著高于未经过预处理的提取效率2.011mg/g。

附图说明

图1为实施例2中深度共熔溶剂的含水量对提取效率的影响。

图2为实施例2中深度共熔溶剂的预处理温度对提取效率的影响。

图3为实施例2中深度共熔溶剂的预处理时间对提取效率的影响。

图4为实施例2中的深度共熔溶剂的含水量、处理时间和处理温度三因素对天然右旋龙脑提取效率影响的相应面图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

1.深度共熔溶剂的合成

将用于合成的药品(氢键受体是氯化胆碱，氢键供体如表1所示)放置于45℃干燥箱内干燥24h后，按照表1相应的摩尔比精确称量对应质量的药品放置于平底烧瓶中，封口膜密封后转入恒温磁力搅拌器上80℃的水浴中，在300rpm的转速下加热搅拌约2～3h，直至形成均一稳定的透明溶液，冷却至室温后于干燥器内密封保存。

2.不同深度共熔溶剂预处理梅片树叶片

将梅片树叶粉碎后精确称量1g样品，分别加入50ml已合成的深度共熔溶剂，混合均匀后放置在60℃的恒温磁力搅拌器上，在300rpm的转速下加热搅拌处理5h。处理结束后将混合物置于高速离心机在25000rpm下离心10min，分离固体颗粒并用清水冲洗2～10min，用滤纸包包裹后放入索氏提取器，用无水乙醇循环提取至提取室内液体颜色不再变化，提取液gc检测其中右旋龙脑含量，并计算提取率。

3.气相色谱法(gc)的条件

db-5型石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)，进样口温度220℃，进样量1μl，不分流进样；检测器温度250℃；升温程序为：起始温度70℃，然后以3℃/min的速度逐渐升温至100℃，再以15℃/min的速度升温至250℃，载气为氦气，流速2ml/min。

4.计算提取率

以乙醇为溶剂，将右旋龙脑标准品分别配制成不同浓度的待测液测量，以右旋龙脑峰面积和相对应浓度建立坐标系绘制标准曲线，并得到回归方程。根据测得峰面积，查标准曲线，计算提取液中右旋龙脑的含量，计算提取效率。

提取率(mg/g)＝右旋龙脑提取量(mg)/梅片树叶片质量湿重(g)。

表1梅片树叶片的提取效率

注：表1中上标中不同的字母表示有显著性差异(p<0.05)，统计分析使用spss中的ducan方法。

由于糖类与氯化胆碱混合后粘度较大，只有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖这几种需要加水，如表1所示。从表1的结果中可以看出，大多数深度共熔溶剂进行预处理能够显著提高梅片树叶片提取天然右旋龙脑的提取效率。氢键供体为乙二醇和蔗糖时，提取效率较高，且与其他(乳酸、麦芽糖除外)提取效率有显著差异，尤其与未经预处理的提取效率提高近75％。因此选择获取方便、成本较低的蔗糖与氯化胆碱合成深度共熔溶剂进行梅片树叶提取的预处理。

实施例2

本实施例用于预处理梅片树叶的方法和条件。

1.预处理梅片树叶条件的单因素分析

选取氯化胆碱：蔗糖摩尔比＝5：2的深度共熔溶剂为预处理溶液，分别考察预处理温度(30℃、45℃、60℃、75℃和90℃)、处理时间(2h、4h、6h、8h和10h)和深度共熔溶剂含水量(氯化胆碱：蔗糖：水的摩尔比为5:2:2、5:2:6、5:2:10、5:2:14和5:2:18)对天然右旋龙脑提取率的影响。当研究某个因素的作用时，仅改变这个因素，其他因素固定不变，分析这一因素对天然右旋龙脑提取效率的影响。

从图1-3可知随着含水量的增大，预处理后梅片树叶的提取率先增大，当含水量从6mol增大到10mol时，天然右旋龙脑的提取率有所下降，继续增加含水量会使天然右旋龙脑的提取率小幅波动，但其数值都低于6mol含水量的提取率，因此单因素含水量中选取氯化胆碱：蔗糖：水的摩尔比为5:2:6来合成深度共熔溶剂。这是由于深度共熔溶剂中含水量太低，溶剂粘度过大，不利于溶剂与被提取物的接触，含水量过高时，由于水的作用，减少了溶剂中水以外其他成分与被提取物的作用，因此也不利于提取。

温度因素考察结果表明，随着处理温度由30℃提升到45℃，右旋龙脑的提取率有所上升，这可能是由于温度升高，粘度减小的原因；当温度从45℃升高到60℃后，右旋龙脑本身的丢失，引起提取率有所下降，因此预处理温度单因素选择45℃为佳。

当处理时间从2h增加到4h时，右旋龙脑提取率明显增加，当处理时间从4h增加到6h时，右旋龙脑的提取率有所下降，进一步延长处理时长后右旋龙脑的提取率稳定在4h处理的提取率之下。因此预处理时间单因素选择4h为佳。

2.box-behnkendesign(bbd)试验设计优化预处理条件

基于上述单因素实验结果，选取含水量、处理时间和处理温度三个因素，采用三因素三水平与5个中心点的bbd响应面法对梅片树叶预处理过程进行优化，使用design-expert进行数据分析，具体设计如表2所示。其中，a代表含水量；b代表预处理温度；c代表预处理时间。在不同条件下，bbd试验设计预处理结果见表3。

表2bbd试验设计中的因素和水平

表3bbd试验设计与结果

注：a代表含水量；b代表预处理温度；c代表预处理时间；y代表提取率

对表3的结果采用design-expert对bbd结果进行模拟分析，得到提取率y对含水量a、处理温度b和处理时间c的二次多项式回归方程为：y＝-0.075a-0.035b+0.044c+0.022ab-0.12ac-0.011bc-1.68a²-0.56b²-0.64c²+4.93，对以上方程进行方差分析，结果如表4所示。

表4bbd试验方差分析

根据方差分析的结果，三因素整体模型的p值(<0.0001)是有显著意义的，二次方的系数(a²,b²或c²)也有显著意义，但线性系数(a,b和c)及其上述两者之间的相互作用无显著意义，相关系数r²＝0.9892＞0.9，因此以上模型可用于预测深度共熔溶剂对梅片树叶预处理效果预测。

图4为含水量、处理时间和处理温度三因素对天然右旋龙脑提取效率影响的相应面图。其中，a为含水量，b为处理温度，c为处理时间。从图4中看出随着三因素中两个因素的变化(一个固定在中间值)，提取率的变化情况。从图4及利用线性回归方程都能确定预处理的最佳条件：含水量摩尔比为5:2:5.9，处理温度44.5℃，处理时间4.07h，在此条件下天然右旋龙脑的提取率为4.936mg/g。此提取率显著高于未经预处理材料在索氏提取法下的提取率，说明上述深度共熔溶剂预处理具有促进右旋龙脑提取的效果(2.011mg/g)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。