提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，涉及提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法，具体涉及一种在生物制药和生物去污领域提高菌株生长速度和防止菌株退化的方法。

背景技术：

红球菌属类微生物在生物制药和治理环境污染方面都有重要的作用。以红球菌属类微生物制备的细胞壁肽聚糖类物质能增强体内巨噬细胞和自然杀伤细胞的免疫活力，具有抑制癌细胞、减少肿瘤复发的功能作用。同时，该类微生物还可作为生物去污的接种介体，可被红球菌属菌株降解、去污的污染物主要有烃类、氯化烃、芳香烃、硝基芳香化合物、多环芳烃化合物、放射性重金属及其聚合物。高渗环境会造成红球菌属在生长过程中发生细胞渗透压失衡、胞内水份外流导致细胞质壁分离，生长速度下降、生长受到抑制，甚至死亡，大大降低了生长存活力；并且会加速菌株的变异，当变异细胞达到一定程度，就会使菌株的某些特性发生改变或丧失，导致菌株的退化。

红球菌属类微生物的生长环境中溶液盐浓度增加会导致溶液渗透压的升高，菌体为了维持细胞内外的渗透压，通常会产生相容性物质，该类物质是一类极性的、易溶的并且可以在细胞内高浓度积累同时对细胞主要功能和蛋白质分子正确折叠起到促进作用的小分子物质。相容性物质在嗜盐菌属菌株中广泛存在，然而红球菌属在不良环境胁迫下是否表达或转运相容性物质，表达或转运的相容性物质是否对其具有抗胁迫作用及它们是否具有交互作用，还未见报道和应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种使红球菌属类微生物在不良环境的胁迫下提高其生长速度和防止菌株退化的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

在含有红球菌属类微生物的环境中添加相容性物质，所述的相容性物质为嘧啶类或氨基酸类相容性物质，选自四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸中的一种或几种；按照菌类的发酵液体积计算，其浓度为10～60mol/l，优选为15-60mol/l。

所述的含有红球菌属类微生物的环境中可以含有高渗盐。

所述的高渗盐选自：nacl、nαso4、kcl中的一种或几种，其浓度为：5％-20％。

本发明的相容性物质通过如下方法选择：

(1)对红球菌属类微生物进行基因组比对，根据比对结果确定红球菌属菌株具有相容性物质的生物合成基因簇；

(2)以红球菌(rhodococcusrubersyp-a8695,其16srrna序列在ncbi的接收号为mh712435，相容性物质四氢嘧啶合成基因簇序列在ncbi的接收号为mh720339)属菌株为实验对象，进行发酵培养和高盐胁迫性实验，确定菌株适宜的相容性物质需求浓度(10-40mmol/l)；

(3)在最适的相容性物质四氢嘧啶浓度下，通过比较高盐浓度下菌株的生长曲线和形态特征，发现相容性物质四氢嘧啶可以提高红球菌属菌株生长速度，并能维持菌体的正常形态、防止红球菌退化。

具体地，

本发明的相容性物质通过如下方法选择：具体步骤如下：

(1)对红球菌属类微生物已公开的全基因组序列进行基因水平次级代谢产物的预测，发现已公开的13株红球菌类微生物的全基因组均含有相容性物质四氢嘧啶合成基因簇；

(2)对红球菌属菌株在不同盐(nacl)浓度(0～40％)下培养，检测相容性物质的产生；

(3)使用超纯水溶解相容性物质，得到不同浓度(0-40mol/l)的相容性物质溶液，使用0.22μm滤膜对相容性物质溶液过滤除菌；

(4)从冻干保藏管中活化红球菌属(rhodococcus)目标菌株，观察冻干菌体在不同浓度(0-40mmol/l)相容性物质的培养基中的生长速度和生物量，将活化好的目标菌株接入到发酵培养基中，混匀；

(5)将步骤(3)中不同浓度(0-40mol/l)的相容性物质溶液加入到步骤(4)中的发酵培养基中，使发酵培养基中相容性物质的浓度为0-40mmol/l进行红球菌属菌株(如，rhodococcusaerolatus,rhodococcusaetherivorans,rhodococcusagglutinans,rhodococcusaichiensis,rhodococcusantrifimi,rhodococcusartemisiae或rhodococcusaurantiacus，但不限于上述菌株)最适相容性物质浓度筛选；

(6)按照步骤(4)中筛选得到的对应菌株最适相容物质的浓度(10-40mmol/l)，进行目标菌株发酵；对在不同发酵条件中生长的菌体进行生长曲线的绘制和形态学观察，确定菌体的生长速度和稳定性。发现相容性物质不仅能提高菌种的生长速度和生物量，还具有防止菌种退化的作用。

步骤(1)中，所述的次级代谢产物预测平台为：

https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start；

所述红球菌属全基因组数据平台为：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？；

所述的目标菌株为红球菌属，例如：

rhodococcusruber(rhodococcusrubersyp-a8695,mh712435),

rhodococcusbiphenylivorans(rhodococcussp.2g,nz_cp018063.1),

rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.008,nz_cp012749.1),

rhodococcuscerastii(rhodococcussp.b7740,nz_cp010797.1),

rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.bh4,nz_cp014941.1)等。

以rhodococcusrubersyp-a8695为例，在15％高渗盐浓度下培养72h活菌数仅为6.2×10⁶cfu·ml^-1，而加入适量相容性溶质后，在15％高渗盐浓度的条件下培养72h后，活菌数可提高近100倍，达5.8×10⁸cfu·ml^-1，显著增加该菌株对不良环境的耐受。

本发明是将红球菌属菌体接种在不同浓度相容性物质的培养基中，从而提高菌体的生长速度、生物量。

所述的红球菌属菌体可以为冻干菌体。

本发明所述的提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化的方法，包括如下步骤：

(1)使用超纯水溶解相容性物质，得到相容性物质溶液，过滤除菌；

(2)将活化好的红球菌属菌株接入到发酵培养基中，混匀，所述的发酵培养基配方为：酵母浸粉4-5‰，葡萄糖4-5‰，麦芽粉2-3‰，复合维生素少许，微量盐1‰，蒸馏水1l；或蛋白胨10-15‰，酵母浸粉4-6‰，nacl4-6‰，琼脂15-20‰，蒸馏水1l；ph7.0-7.2。

(3)将步骤(1)中的相容性物质溶液加入到步骤(2)中的发酵培养基中，观察菌株的生长曲线和形态特征。

以红球菌株(rhodococcusrubersyp-a8695,mh712435)及相容性物质四氢嘧啶为例，本发明将冻干保存并经长期保藏的菌体接种在含有不同浓度相容性物质的培养基中，可观察到菌体在含有相容性物质的培养基中生长速度和生物量相对于在不含相容性物质的培养基中生长速度加快，生物量增多；经过实验摸索合适的相容性物质浓度，在菌体发酵过程中通过投放合适浓度的相容性物质，发现相容性物质能促进菌体的生长，使菌体的生长速度加快、生物量提高，其具有以下优点：

1.本发明可使红球菌属菌株冻干菌体生长速度和生物量提升，使菌体在冻干保存后仍能保持良好的生长状态，遗传稳定性提高；

2.本发明还可应用在冻干菌体复苏中，提高冻干菌体的生长速度，缩短发酵周期，节约生产成本；

3.本发明可使红球菌属在胁迫条件下与非胁迫条件下保持近似的生长速度、生物量及菌体形态特征，防止细菌发生退化；提升菌体在不良环境下的生长速度，提高生物量；

4.本发明中的使用的相容性物质为嘧啶类或氨基酸类相容性物质，在提高菌体生长速度和防止菌体退化的同时，还能补充嘧啶和氨基酸，维持为菌体生长提供营养元素所使用的相容性物质，并且投入环境后无毒无害。

附图说明

图1红球菌属菌株相容性物质四氢嘧啶合成基因簇蛋白序列比对结果。

a,ecta蛋白序列比对结果；1,rhodococcusbiphenylivorans(rhodococcussp.2g,nz_cp018063.1)；2,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.008,nz_cp012749.1)；3,rhodococcuscerastii(rhodococcussp.b7740,nz_cp010797.1)；4,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.bh4,nz_cp014941.1)；5,rhodococcusbaikonurensis(rhodococcussp.h-ca8f,nz_cp023720.1)；6,rhodococcusmaanshanensis(rhodococcussp.mtm3w5.2,nz_cp019572.1)；7,rhodococcuspyridinivorans(rhodococcussp.p52,nz_cp016819.1)；8,rhodococcuscorynebacterioides(rhodococcussp.pbts1,nz_cp015219.1)；9,rhodococcuscerastii(rhodococcussp.pbts2,nz_cp015220.1)；10,rhodococcusjostii(rhodococcussp.s2-17,nz_cp021354.1)；11,rhodococcusruber(rhodococcusrubersyp-a8695,mh720339)；12,rhodococcusaetherivorans(rhodococcussp.wb1,nz_cp015529.1)；13,rhodococcusnanhaiensis(rhodococcussp.wmma185,nz_cp017014.1)；14,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.yl-1,nz_cp017299)；15,bacillushaloduransecta(abp52051.1)；16,chromohalobactersp.njs-2ecta(abo87371.1)；17,halobacillushalophilusdsm2266ecta(abx39523.1)；18,halomonaselongatadsm3043ecta(caa09483.1)；19,methylobacteralcaliphilusecta(aay96770.1)；20,methylophagaalcalicam8ecta(aby40744.1)；21,nesterenkoniahalobiadsm20541ecta(abs82494.1)；22,nocardiopsisgilvayim90087ecta(asu82339.1)；23,prauserellaalbayim90005ecta(aej36139.1)；24,streptomycespactumact12ecta(amy60488.1)；25,virgibacillushalodenitrificanspdb-f2ecta(anv28159.1)；

b,ectb蛋白序列比对结果；1,rhodococcusbiphenylivorans(rhodococcussp.2g,nz_cp018063.1)；2,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.008,nz_cp012749.1)；3,rhodococcuscerastii(rhodococcussp.b7740,nz_cp010797.1)；4,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.bh4,nz_cp014941.1)；5,rhodococcusbaikonurensis(rhodococcussp.h-ca8f,nz_cp023720.1)；6,rhodococcusmaanshanensis(rhodococcussp.mtm3w5.2,nz_cp019572.1)；7,rhodococcuspyridinivorans(rhodococcussp.p52,nz_cp016819.1)；8,rhodococcuscorynebacterioides(rhodococcussp.pbts1,nz_cp015219.1)；9,rhodococcuscerastii(rhodococcussp.pbts2,nz_cp015220.1)；10,rhodococcusjostii(rhodococcussp.s2-17,nz_cp021354.1)；11,rhodococcusruber(rhodococcusrubersyp-a8695,mh720339)；12,rhodococcusaetherivorans(rhodococcussp.wb1,nz_cp015529.1)；13,rhodococcusnanhaiensis(rhodococcussp.wmma185,nz_cp017014.1)；14,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.yl-1,nz_cp017299)；15,bacillushaloduransectb(abp52052.1)；16,chromohalobactersp.njs-2ectb(abo87372.1)；17,halobacillushalophilusdsm2266ectb(abx39524.1)；18,halomonaselongatadsm3043ectb(caa09484.1)；19,methylobacteralcaliphilusectb(aay96771.1)；20,methylophagaalcalicam8ectb(aby40745.1)；21,nesterenkoniahalobiadsm20541ectb(abs82495.1)；22,nocardiopsisgilvayim90087ectb(asu82344.1)；23,prauserellaalbayim90005ectb(aej36141.1)；24,streptomycespactumact12ectb(amy60489.1)；25,virgibacillushalodenitrificanspdb-f2ectb(anv28160.1)；

c,ectc蛋白序列比对结果；1,rhodococcusbiphenylivorans(rhodococcussp.2g,nz_cp018063.1)；2,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.008,nz_cp012749.1)；3,rhodococcuscerastii(rhodococcussp.b7740,nz_cp010797.1)；4,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.bh4,nz_cp014941.1)；5,rhodococcusbaikonurensis(rhodococcussp.h-ca8f,nz_cp023720.1)；6,rhodococcusmaanshanensis(rhodococcussp.mtm3w5.2,nz_cp019572.1)；7,rhodococcuspyridinivorans(rhodococcussp.p52,nz_cp016819.1)；8,rhodococcuscorynebacterioides(rhodococcussp.pbts1,nz_cp015219.1)；9,rhodococcuscerastii(rhodococcussp.pbts2,nz_cp015220.1)；10,rhodococcusjostii(rhodococcussp.s2-17,nz_cp021354.1)；11,rhodococcusruber(rhodococcusrubersyp-a8695,mh720339)；12,rhodococcusaetherivorans(rhodococcussp.wb1,nz_cp015529.1)；13,rhodococcusnanhaiensis(rhodococcussp.wmma185,nz_cp017014.1)；14,rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.yl-1,nz_cp017299)；15,bacillushaloduransectc(abp52053.1)；16,chromohalobactersp.njs-2ectc(abo87373.1)；17,halobacillushalophilusdsm2266ectc(abx39525.1)；18,halomonaselongatadsm3043ectc(caa09485.1)；19,methylobacteralcaliphilusectc(aay96772.1)；20,methylophagaalcalicam8ectc(aby40746.1)；21,nesterenkoniahalobiadsm20541ectc(abs82496.1)；22,nocardiopsisgilvayim90087ectc(asu82345.1)；23,prauserellaalbayim90005ectc(aej36140.1)；24,streptomycespactumact12ectc(amy60490.1)；25,virgibacillushalodenitrificanspdb-f2ectc(anv28161.1).

图2不同盐浓度下菌体可产生相容性物质四氢嘧啶。

a，不同盐浓度下细胞内四氢嘧啶含量；b，不同盐浓度下细胞外四氢嘧啶含量；c,菌体产生的四氢嘧啶hplc检测结果。

图3不同浓度四氢嘧啶对菌体生物量的影响。

图4四氢嘧啶对冻干菌体萌发速率及生物量的影响。

图5四氢嘧啶对菌体生长的影响。

a,四氢嘧啶对菌落形态的实验结果；b，四氢嘧啶对菌体生长速度及生物量的影响结果。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限制。

如下实施例中：

次级代谢产物预测平台为：

https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start；

红球菌属全基因组数据平台为：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？；

基因比对软件为：bioeditsequencealignmenteditorversion7.0.5.3；

发酵培养基配方(l^-1)：4.0g酵母浸粉，2.0g麦芽粉，4.0g葡萄糖，复合维生素少许，1.0g盐,1000ml蒸馏水；

固体培养基：如上培养基配方添加20.0g琼脂即为固体培养基；

相容性物质采用四氢嘧啶；

实验菌株采用rhodococcusrubersyp-a8695。

实施例1红球菌属微生物相容性物质四氢嘧啶合成基因簇的发现及比对

(1)在红球菌属基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？)中寻找到13株已报道全基因组序列的菌株:rhodococcusbiphenylivorans(rhodococcussp.2g,nz_cp018063.1),rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.008,nz_cp012749.1),rhodococcuscerastii(rhodococcussp.b7740,nz_cp010797.1),rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.bh4,nz_cp014941.1),rhodococcusbaikonurensis(rhodococcussp.h-ca8f,nz_cp023720.1),rhodococcusmaanshanensis(rhodococcussp.mtm3w5.2,nz_cp019572.1),rhodococcuspyridinivorans(rhodococcussp.p52,nz_cp016819.1),rhodococcuscorynebacterioides(rhodococcussp.pbts1,nz_cp015219.1),rhodococcuscerastii(rhodococcussp.pbts2,nz_cp015220.1),rhodococcusjostii(rhodococcussp.s2-17,nz_cp021354.1),rhodococcusruber(rhodococcusrubersyp-a8695,mh712435),rhodococcusaetherivorans(rhodococcussp.wb1,nz_cp015529.1),rhodococcusnanhaiensis(rhodococcussp.wmma185,nz_cp017014.1),rhodococcusqingshengii(rhodococcussp.yl-1,nz_cp017299)；对13株已报道全基因组序列的红球菌进行次级代谢产物分析，发现13株已报道全基因组序列的红球菌均具有相容性物质四氢嘧啶合成基因ectabc。

(2)获取13株红球菌四氢嘧啶合成基因簇，分别与已知四氢嘧啶合成基因簇进行氨基酸水平比对，发现13株红球菌的四氢嘧啶合成基因簇与已知的可产生四氢嘧啶的合成基因ectabc蛋白质相似度分别达到68.48％,86.46％和84.78％(图1)，说明红球菌属类微生物可能具有四氢嘧啶合成基因。

实施例2以一株赤红球菌(rhodococcusrubersyp-a8695,mh712435)为例，说明不同盐浓度下，红球菌属类微生物可产生四氢嘧啶。

(1)分别配制含有0％，5％，10％，15％，20％nacl的液体培养基，接种等量菌体于液体培养基中，28℃温度下培养，制备菌体发酵液；

(2)四氢嘧啶hplc检测样品准备。

取菌体发酵液，11000rpm·min^-1离心10min。

细胞外四氢嘧啶检测样品：菌体发酵液离心的上清液，可直接用于液相检测；

细胞内四氢嘧啶检测样品：即菌体发酵液离心的沉淀部分使用100mmol·l^-1ph7.2磷酸盐缓冲液洗涤三次，将洗涤后的菌体分散在2ml80％(v/v)乙醇溶液中，室温200rpm·min^-1震摇过夜提取，11000rpm·min^-1离心10min，取上清液备检；

(3)hplc检测。

液相条件：流速1.0ml·min^-1，柱温35℃，流动相乙腈/水(20/80，v/v)，检测波长210nm。

结果表明该菌株在nacl压迫下可产生四氢嘧啶，不存在盐压迫时则不产生四氢嘧啶；随着培养基盐浓度的增高，细胞外的四氢嘧啶总量升高(图2)。

实施例3以赤红球菌为例，说明不同浓度四氢嘧啶，具有提高红球菌属类微生物的生物量的作用

(1)使用无菌双蒸水分别配制100mmol·l^-1的四氢嘧啶，使用无菌0.22μm滤膜过滤四氢嘧啶溶液于无菌ep管中，4℃保存，备用；

(2)分别配制含有浓度为0mmol·l^-1，5mmol·l^-1，10mmol·l^-1，15mmol·l^-1，20mmol·l^-1，30mmol·l^-1，40mmol·l^-1，50mmol·l^-1，60mmol·l^-1的四氢嘧啶液体培养基，接种等量菌体于含有15％nacl的固体培养基上，适宜温度下培养5d；

(3)测定各培养基中的菌体干重。实验结果表明，当四氢嘧啶浓度为10-20mmol·l^-1范围内菌体干重达到最大值；syp-a8695最适的四氢嘧啶含量为15mmol·l^-1时菌体干重达0.8gcdw，如图3所示。

实施例4以赤红球菌为例，说明在最适四氢嘧啶浓度下具有促进冻干菌体萌发速率的作用

(1)分别配制含有浓度为15mmol·l^-1的四氢嘧啶固体培养基，接种等量菌体于固体培养基上，28℃下培养5d；

(2)取等量菌体制成牛奶冻干保藏管，4℃保存五个月；

(3)取制得的牛奶冻干管，于冻干管中加入500μl无菌生理盐水溶解，取50μl冻干管中的水溶液，接种于50ml液体培养基中测定菌体的生长曲线，观察相容性物质四氢嘧啶对冻干保藏菌生长速度及生物量的影响。实验结果表明在含有四氢嘧啶的条件下对菌体进行培养，经冻干保存后更有利于菌体的复苏，使菌体的复苏量增大、复苏时间缩短，维持菌体的遗传稳定性，如图4。

实施例5以赤红球菌为例，说明四氢嘧啶具有促进菌体生长的作用

(1)配制含有15％nacl的固体培养基和液体培养基，灭菌后放冷至60℃左右，加入四氢嘧啶溶液，使四氢嘧啶的终浓度为15mmol·l^-1，备用；

(2)接种等量菌种于上述培养基中，固体培养基28℃培养5d，观察菌体菌落形态；测定菌体在液体培养基中的生长曲线。说明四氢嘧啶可使菌体在盐压迫下生长速度加快、生物量提升，维持菌体菌落正常形态，如图5。