一株重组鸭干扰素-α乳杆菌的构建及其应用的制作方法

本发明涉及一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌的构建及其应用，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
：当前，养鸭业正向着集约化、规模化和商品化的进程迈进，而鸭群的发病率越来越高，且趋于复杂化，严重影响了鸭养殖业的健康发展。目前，我国预防和控制鸭病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸭alpha干扰素(duifn-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒病、鸭流感等病毒性疾病有较好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留和不产生耐药性等优点，因此duifn-α产品的研发对鸭病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。乳杆菌(lactobacillus)是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的统称。由于lab具有食品级和益生菌的特点，与其它宿主菌株相比，我们利用乳杆菌杆菌作为表达系统，可以更充分利用它的优点，其优势主要通过以下几个方面来进行体现：(1)从目前来看，乳杆菌对于人和动物的机体并没有致病性存在，是安全食品级菌株，为生产绿色安全的食品提供了保障；(2)在人和动物体内的数量较多，对于机体健康起到有益作用，与其它菌株相比，用乳杆菌作为宿主菌表达外源基因，可以获得较高的蛋白表达量；(3)乳杆菌的菌体本身和其分泌的多种物质对于机体均产生的是益生作用，如果使用乳杆菌作为宿主体，携带外源基因进行蛋白表达，这样就可以将菌体、自身分泌物质和外源蛋白三者结合到一起，发挥更大的作用；(4)乳杆菌可以粘附在机体粘膜上，不容易脱落，因此以乳杆菌为宿主菌，构建的基因工程菌可以在机体粘膜处长时间的定植，从而不断繁殖，进而不间断产生目的蛋白向机体释放；(5)因为乳杆菌进入胃及肠道后，可以耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，所以重组乳杆菌可以直接口服，由于这一特点可不用进行这样的繁琐步骤例如将目的蛋白进行体外提纯和后加工的一些过程。利用乳杆菌作为表达系统最大价值在于其安全、没有内毒素，表达的外源蛋白可以直接连同菌体一起服用。而且乳杆菌为机体正常菌群，可以在肠道中存活定植，因此口服基因工程乳杆菌后，表达的目的蛋白就可以源源不断在肠道中生产并起到相应的作用。乳杆菌作为表达系统来表达干扰素，既具有乳杆菌的益生性，又可发挥干扰素的生物学功能，并且直接以活菌制剂的形式进行饲喂，可以简化工业上生产程序，降低了饲养成本，同时也为以乳杆菌为传递系统开发人类及动物干扰素类产品开辟新途径，具有广阔的应用前景。技术实现要素：本发明的目的是基于基因重组duifn-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，选择ppg612.1载体为表达载体，以乳杆菌(lactobacillus)casei393株菌为宿主菌构建乳杆菌(lactobacillus)duifn-α-ppg612.1/l.393重组菌株并在2％木糖条件下诱导该菌株表达duifn-α蛋白。本发明的技术方案：1.一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组鸭alpha干扰素乳杆菌含有连接有如序列3所述duifn-α目的基因的表达载体获得的重组表达载体duifn-α-ppg612.1；该重组菌株被命名为乳杆菌(lactobacillus)duifn-α-ppg612.1/l.393菌株，简称重组乳杆菌duifn-α株，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.17049。2.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于其中序列3为duifn-α目的基因核苷酸序列为：3.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该重组菌的表达的外源蛋白为鸭alpha干扰素；该表达产物不经分离纯化，直接制成活菌制剂。4.如权利要求1所述一株重组鸭alpha干扰素乳杆菌，其特征在于该该重组菌是通过以下步骤构建的：(1)以提取的鸭肝脏基因组dna为模板扩增出duifn-α目的基因片段；(2)回收并纯化目的基因片段经测序，测序结果确认该pcr产物确为duifn-α目的基因；(3)将经双酶切的ppg612.1表达载体与步骤(2)中的目的基因片段连接获得重组duifn-α-ppg612.1表达载体；(4)将重组duifn-α-ppg612.1表达载体经电转化转入lactobacilluscasei株(即：atcc393株)乳杆菌细胞中后涂布含有氯霉素的mrs培养平板，37℃静置培养36h后挑取阳性克隆子经测序确认，获得构建阳性重组乳杆菌菌株，该重组菌株被命名为乳杆菌(lactobacillus)duifn-α-ppg612.1/l.393菌株，简称乳杆菌duifn-α株，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.17049。本发明的有益效果乳杆菌(lactobacillus，英语名：lacticacidbacteria，lab)是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的统称。由于lab具有食品级和益生菌的特点，与大肠杆菌等表达系统相比，lab系统的最大价值在于其表达的重组蛋白可以不经分离纯化，直接制成活菌制剂后，通过黏膜途径用于机体而达到治疗目的。将干酪乳杆菌与鸭干扰素二者结合，重组菌株将既具有乳杆菌的益生性，又可发挥干扰素的生物学功能，并且直接以活菌制剂的形式进行饲喂，可以简化生产程序，降低了饲养成本，同时也为以乳杆菌为传递系统开发人类及动物干扰素类产品开辟新途径。附图说明图1duifn-α目的基因pcr扩增产物经1％dna琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中marker为plusiidnamarker。图2重组duifn-α蛋白诱导表达结果，图中m为thermoscientificpagerulerprestainedproteinladder(货号：26617；10-180kd)；1为ppg612.1空载体诱导表达样品；2为duifn-α诱导表达样品；3为duifn-α未诱导表达样品。本发明涉及的生物材料资源信息本发明人应用生物技术构建的重组乳杆菌duifn-α-ppg612.1/l.393菌株作为生产菌株，并通过2％木糖成功诱导表达具有生物活性的duifn-α蛋白。该重组菌株已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.17049；乳杆菌lactobacilluscasei株(atcc393株，购买自北京北纳创联生物技术研究院)；人羊膜毛细胞(wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司，上海市崇明县上海泰和经济发展区长兴镇潘园公路1800号2号楼9703室)；水泡性口炎病毒(vsv病毒，2013年3月购自北京北纳创联生物技术公司)。本发明的具体实施方式1.根据ncbi核酸数据库中搜索编码duifn-α蛋白的576bp核苷酸序列(genbank:ab128861)在此基础上本发明人设计：在基因序列1的5’端终止密码子前添加组氨酸(his)标签以便于蛋白纯化，同时在目的片段两侧添加xbai和nhei限制性内切酶位点用于获得线性化ppg612.1表达载体，然后通过primerpremier5分析软件分别设计转录pcr中的引物(序列1和2)，同时可用于目的基因片段序列。见表1。表1转录pcr引物序列2.以鸭肝脏基因组dna为目的基因片段模板。经对提取的鸭肝脏基因组dna用序列1和序列2引物进行扩增，扩增出duifn-α目的基因片段，结果见图1；回收并纯化目的基因片段送去测序，测序结果表明该pcr产物为duifn-α目的基因，其核苷酸序列为序列33.双酶切ppg612.1表达载体(ppg612.1表达载体购自普如汀生物技术(北京)有限公司)并将其与目的基因片段连接，连接产物经电转化转入乳杆菌(lactobacillus)casei株(购买自北京北纳创联生物技术研究院)细胞中，后将其涂布于含有氯霉素的mrs培养平板，37℃静置培养36h后挑取阳性克隆子送去测序。测序结果显示重组多克隆载体上目的基因片段核苷酸序列与ncbi上duifn-α基因的核苷酸序列的匹配度为96.8％，表明本研究成功构建重组菌，被命名为乳杆菌(lactobacillus)duifn-α-ppg612.1/l.393菌株(简称乳杆菌duifn-α株)，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.17049。4.通过添加木糖条件下诱导该菌株实现目的蛋白duifn-α的诱导表达，即将重组乳杆菌duifn-α-ppg612.1/l.393菌株在2％木糖条件37℃培养诱导20h，实现目的蛋白的诱导表达；最后以细胞病变抑制法检测重组duifn-α蛋白的生物学活性。细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的duifn-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(vsv病毒，2013年3月购自北京北纳创联生物技术公司)在人羊膜毛细胞(wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司)上增殖，说明其具有良好的生物学活性。根据reed-muench法计算该菌株诱导的duifn-α蛋白生物学效价为1～3×105iu/ml。实施例以下实施例为进一步说明本发明的技术方案，不对本发明要求保护的技术方案构成限制。实施例1——重组乳杆菌duifn-α-ppg612.1/l.393菌株构建1.引物合成根据ncbi核酸数据库中搜索编码duifn-α蛋白的576bp核苷酸序列(genbank:ab128861)在此基础上本发明人设计：在基因序列1的5’端终止密码子前添加组氨酸(his)标签以便于蛋白纯化，同时在目的片段两侧添加xbai和nhei限制性内切酶位点用于获得线性化ppg612.1表达载体，然后通过primerpremier5分析软件分别设计转录pcr中的引物(序列1和序列2)，同时可用于目的基因片段序列。2.鸭肝脏基因组dna的采集剖杀鸭只，无菌采集鸭肝脏组织，采集的鸭肝脏组织立即进行全基因组dna的提取。3.全基因组dna提取按照全式金easypuregenomicdnakit(codeno.ee101)使用说明书提取鸭肝脏组织的全基因组dna。4.duifn-α目的基因的扩增使用全式金2×easytaqpcrsupermix(codeno.as111)对提取的鸭肝脏组织的全基因组dna进行扩增反应，反应体系和反应条件分别见表2和表3。pcr反应结束后取5μl反应产物进行1％dna琼脂糖凝胶电泳。按照全式金easypurequickgelextractionkit(codeno.eg101)使用说明书回收目的片段并测序。上述扩增反应中使用的引物为：上游引物duifnα-pcrf：cgcgcgctagctctagaatgcatcatcatcatcatcatcctgg43(序列1)下游引物duifnα-pcrr：cgtctagagctagcttagcgcatggtgcgg30(序列2)表2duifn-αpcr扩增反应体系反应组分体积(μl)基因组dna0.8forwardprimer(10μm)1reverseprimer(10μm)12×easytaqpcrsupermix25ddh2o22.2表3duifn-αpcr扩增反应条件5.重组duifn-α-ppg612.1质粒lactobacillus393乳杆菌菌株构建用xbai和nhei限制性内切酶在37℃条件下双酶切ppg612.1质粒，反应体系见表4。双酶切后按照全式金easypurequickgelextractionkit(codeno.eg101)的使用说明书将回收的duifn-α目的基因片段(即重组duifn-α基因，其基因序列为序列3)和已线性化的ppg612.1质粒在16℃条件下连接过夜，反应体系见表5。连接后取20μl连接产物经电转化转入lactobacilluscasei株(atcc393)乳杆菌感受态细胞中后涂布含有氯霉素的mrs培养平板，37℃静置培养36h后挑取阳性克隆子测序后保种，该菌株被命名为重组乳杆菌duifn-α-ppg612.1/l.393株(简称重组乳杆菌duifn-α株)，并已于2018年12月28日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.17049。表4ppg612.1质粒双酶切反应体系反应组分体积(μl)ppg612.1质粒310×mbuffer2.5xbai1nhei1ddh2o17.5表5目的基因片段与载体酶连接反应体系反应组分体积(μl)线性化ppg612.1载体1.510×buffer1.5duifn-α目的基因片段3t4连接酶1ddh2o8序列3重组duifn-α基因核苷酸序列注：加粗标记为组氨酸标签核苷酸序列。实施例2——重组duifn-α蛋白的诱导表达分别取重组duifn-α-ppg612.1/l.393菌株和ppg612.1空载体菌株划线于含有氯霉素的mrs培养平板上，37℃条件下培养36h。挑取阳性重组duifn-α-ppg612.1和ppg612.1空载体单菌落，接种于5ml含氯霉素的mrs液体培养基内，37℃静置培养过夜。取过夜培养的重组duifn-α-ppg612.1/l.393乳杆菌菌液和ppg612.1空载体乳杆菌菌液按1：20比例分别转接5ml含氯霉素的含2％木糖mrs液体培养基(不含葡萄糖)中，37℃条件下培养诱导20h，同时设置未经诱导的重组duifn-α-ppg612.1/l.393的菌株作为阴性对照。诱导后的菌液和未诱导的重组菌液分别于常温12000r/min的条件下，离心1min，弃尽上清，沉淀用1ml去离子水洗涤两次，12000r/min离心1min弃尽上清；用500μl10mg/ml溶菌酶，充分悬浮沉淀，37℃水浴60min，每10min颠倒混匀一次。12000r/min离心1min，弃尽上清；再将沉淀用1ml去离子水洗涤两次，12000r/min离心1min，弃尽上清；菌体沉淀用50μl1×pbs悬起，并加入等量2×sds-page蛋白上样缓冲液(含dtt)，充分混匀后，煮沸10min。进行12％sds-page凝胶电泳，最后经考马斯亮蓝染色检测结果。如果构建的重组乳杆菌duifn-α-ppg612.1/l.393株能够诱导表达鸭干扰素蛋白，在2％木糖诱导条件下重组菌株在26kd处能够表达目的蛋白，而空载体菌株由于没有目的基因片段，所以不能表达目的蛋白。同时未经2％木糖诱导表达的重组菌株也无目的蛋白的表达。duifn-α蛋白诱导表达ppg612.1为诱导剂(2％木糖)诱导表达载体，当加入2％木糖的诱导剂时，能够诱导宿主菌表达目的蛋白。基于此，我们对重组duifn-α-ppg612.1/l.393乳杆菌进行诱导表达并检测，考马斯亮蓝染色结果显示在2％木糖诱导条件下，该重组菌株能够在26kd处表达duifn-α蛋白，而同样诱导条件的ppg612.1空载体菌株和未经诱导的重组菌株在26kd处均无目的蛋白的表达，结果见图2。实施例3——重组duifn-α蛋白生物活性鉴定wish细胞消化后以3.0×105个/ml细胞量铺96孔细胞培养板，100μl/孔。铺板后，置于37℃，5％co2培养箱培养24h。粗提取的duifn-α蛋白作100倍稀释，以100倍稀释液为起始浓度作4倍系列稀释，共12个稀释度，每个稀释度作6个重复。取培养24h的wish细胞，弃掉培养基，分别按100μl/孔量加入干扰素样品和标准品到相应的细胞孔，然后置于37℃，5％co2培养箱继续培养24h。培养24h后，按100μl/孔量加入100tcid50的vsv稀释液到细胞孔中，然后置于37℃，5％co2培养箱培养。每组同时设置病毒对照组和正常细胞对照组。当病毒对照孔75％的细胞出现病变时判定各实验组结果，结果判定方法见表6。根据reed-muench计算粗提取的重组duifn-α蛋白的生物学活性。计算公式为干扰素效价＝干扰素半数细胞保护力稀释度×log4的值对log10的反对数。表6细胞病变判断标准重组duifn-α乳杆菌菌株能够在2％木糖条件下表达duifn-α蛋白，但表达的目的蛋白是否具有生物活性即是否具有临床应用价值，还需要进一步的实验进行验证。因此，本研究采用经典细胞病变抑制法对重组duifn-α-ppg612.1/l.393菌株表达的目的蛋白进行生物学活性检测。研究结果表明，该重组菌株表达的duifn-α蛋白能够显著抑制vsv病毒对wish细胞的感染(wish细胞购自上海极威生物科技有限公司)，结果见表7-9。根据表7中的数据，按reed-muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.54，表明粗提取的鸭alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-3.54时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.54log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100×2165＝2.165×105iu/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％的感染分数-50％)/(高于50％的感染分数-低于50％的感染分数)＝(100％-50％)/(100％-6.7％)＝50％/93.3％＝0.54。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.54＝5.54。表7重组duifn-α抑制vsv病毒感染wish细胞显微镜下观察结果根据表8中的数据，按reed-muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.51，表明粗提取的鸭alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-3.51时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.51log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100×2076＝2.076×105。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％的感染分数-50％)/(高于50％的感染分数-低于50％的感染分数)＝(90％-50％)/(90％-11.1％)＝40％/78.9％＝0.51。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.51＝5.51表8重组duifn-α抑制vsv病毒感染wish细胞显微镜下观察结果根据表9中的数据，按reed-muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.25，表明粗提取的鸭alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-3.25时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.25log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100×1448＝1.448×105。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％的感染分数-50％)/(高于50％的感染分数-低于50％的感染分数)＝(66.7％-50％)/(66.7％-0％)＝16.7％/66.7％＝0.25。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.25＝5.25。表9重组duifn-α抑制vsv病毒感染wish细胞显微镜下观察结果附件：北京全式金生物技术有限公司两个产品的操作说明书一、基因组dna提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司easypuregenomicdnakitcodeno.ee101)(一)操作步骤：使用前加不同体积100％乙醇到wb2。所有离心均在室温进行。1.材料处理(1)mammaliancells1)对于贴壁细胞，从培养盘移去培养液，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，250×g，离心5min，弃上清。2)对于悬浮细胞，收集细胞，250×g，离心5min，弃上清。3)加入100μl溶液lb2，充分混匀，悬浮细胞。如需去除rna，可以加入20μlrnasea于样品中，室温孵育2min。4)加入20μlproteinasek于样品中，涡旋混匀，室温孵育2min。(2)mammaliantissues提前准备55℃水浴或金属浴1)将≤25mg切碎的动物组织置于一无菌的1.5ml离心管中。2)加入100μllb2和20μlproteinasek(确保组织完全进入离心管中)3)55℃孵育直至完全裂解(大约3h，因组织不同而异)如需要去除rna，可以加入20μlrnasea于样品中，室温孵育2min。4)12000r/min离心5min，转移上清于一无菌的离心管中。(3)e.coilcells提前准备55℃水浴或金属浴1)取细菌培养液1-5ml，12000×g离心1minminmin，尽量吸净上清。2)向菌体沉淀中加入100μllb2和20μlproteinasek，震荡至菌体彻底悬浮。3)55℃孵育15min。如需要去除rna，可以加入20μlrnasea于样品中，室温孵育2min(4)yeastcells提前准备37℃，55℃水浴或金属浴自备新鲜山梨醇buffer(1msorbitol,10mmedta,14mmβ-mercaptoethanol)自备lyticase1)收集酵母细胞(≤5×107细胞)，12000×g离心1min，尽量吸净上清。2)向菌体沉淀中加入500μl山梨醇buffer，15untislyticase，37℃水浴孵育1小时。3)5000×g离心10min，弃上清。4)向菌体沉淀中加入100μllb2和20μlproteinasek，震荡至菌体彻底悬浮。5)55℃孵育45min。6)12000×g离心5min，转移上清于一无菌离心管中。如需要去除rna，可以加入20μlrnasea于样品中，室温孵育2min。2.加入500μlbb2，立即涡旋5s，室温孵育10min。3.将全部的溶液加入离心柱中，12000×g离心30s，弃去流出液。4.加入500μl溶液cb2，12000×g离心30s，弃去流出液。5.重复步骤4一次。6.加入500μl溶液wb2(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000×g离心30s，弃去流出液。7.重复步骤6一次。8、12000×g离心2min，彻底去除残留的wb2。9.将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50-200μl预热eb(60℃-70℃)，或去离子水(ph>7.0)室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱dna。10.为得到更多的dna，进行第二次洗脱，在柱的中央加入50-200μl预热eb(60℃-70℃)，或去离子水(ph>7.0)室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱dna。洗脱出的dna于-20℃保存。(二)注意事项：样品用量不宜过多，以免影响提取效果。尽量切碎组织，以免影响裂解效果；完全裂解后，裂解液呈粘稠状，非凝胶状。为保证提取dna的质量，使用新鲜的材料，避免反复冻融；dna的质量取决于材料的种类，保存时间等。使用无菌离心管和枪头，避免dnase污染。第二次洗脱可以使用相同的离心管或不同的离心管。二、全式金2×easytaqpcrsupermix(codeno.as111)的操作说明书(目的基因片段的扩增)1.实验操作：(1)推荐pcr体系(以50μl反应体系为例)：componentvolumefinalconcentrationtemplatevariableasrequiredforwardprimer(10μm)1μl0.2μmreverseprimer(10μm)1μl0.2μm2×easytaqpcrsupermix25μl1×nuclease-freewatervariable-totalvolume50μl-(2)pcr反应条件：2.注意事项：使用时彻底化冻、混匀。三、全式金easypurequickgelextractionkit(codeno.eg101)(回收目的片段并测序)1.试剂盒组成：componenteg101-01(50rxns)eg101-02(200rxns)gelsolubilizationbuffer(gsb,yellow)30ml120mlwashbuffer(wb)10ml2×20mlelutionbuffer(eb)5ml10mlgelspincolumnswithcollectiontubes50个2×100个2.操作步骤使用前加入不同体积100％乙醇到wb中规格wb50rxns40ml200rxns2×80ml所有离心均在室温下进行。(1)切取琼脂糖凝胶中的目的dna条带，放入干净的离心管中称量，如100mg，可视为100μl(100mg≈100μl)，以此类推。(2)加入3倍体积溶液gsb，于55℃水浴融胶6-10min，间断(2-3min)混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3m醋酸钠(ph5.2)调整颜色和gsb颜色相同(黄色)。(为增加dna回收量，可加入1倍量体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中，如凝胶重为100mg，加入100μl异丙醇)(3)待融化的凝胶溶液降至室温(高温时离心柱结合dna能力弱)加入离心注中静止1min10000×g离心1min，弃流出液。(4)加入650μl溶液wb，10000×g离心1min，弃流出液。(5)10000×g离心1-2min，彻底去除残留的wb。(6)将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静止1min，使残留乙醇挥发干净，在柱的中央加入30-50μl或去离子水(ph>7.0)(eb或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)，室温静置1min。(7)10000×g离心1min，洗脱dna，将洗脱出的dna于-20℃保存。3.注意事项(1)为了保证回收效果，电泳时使用新鲜电泳缓冲液。(2)切胶时，胶块尽量小：溶胶时，确保胶块完全融化。(3)为了避免紫外照射dna造成损伤，影响下游的实验(如克隆，连接)，紫外照射时间尽量短，而且乳杆菌为为机体正常菌体，可以在肠道中存活定植，因此服用基因工程乳杆菌后，表达的目的蛋白就可以源源不断在肠道中生产并起到相应的作用。序列表<110>大连三仪动物药品有限公司<120>一株重组鸭干扰素-α乳杆菌的构建及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>43<212>dna<213>人工序列(上游引物duifnα-pcrf)<400>1cgcgcgctagctctagaatgcatcatcatcatcatcatcctgg43<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(下游引物duifnα-pcrr)<400>2cgtctagagctagcttagcgcatggtgcgg30<210>3<211>606<212>dna<213>人工序列(duifn-α目的基因核苷酸序列)<400>3tctagaatgcatcatcatcatcatcatcctgggccatcagccccaccaccaccagccatc60tacagcgccctggccctcctgctcctcctcacgcctcccgccaacgccttctcctgcagc120cccctgcgcctccacgacagcgccttcgcctgggacagcctccagctcctccgcaacatg180gctcccagccccacacagccctgcccgcagcaacacgcgccttgctccttcccggacacc240ctcctggacaccaacgacacgcagcaagccgcacacaccgccctccacctcctccaacac300ctcttcgacaccctcagcagccccagcacccccgcgcactggctccacaccgcacgccac360gacctcctcaaccagcttcagcaccacatccaccacctcgagcgctgcttcccagccgac420gccgcgcgcctccacaggcgagggccccgcaaccttcacctcagcatcaacaagtacttc480ggctgcatccaacacttcctccagaaccacacctacagcccctgcgcatgggaccacgtc540cgcctcgaggctcacgcctgcttccagcgcatccaccgcctcacccgcaccatgcgctaa600gctagc606当前第1页12