本发明设计药物化学领域，具体涉及一类特殊的异甾体生物碱及其衍生物的制备方法。
背景技术：
由于人口老龄化，环境污染，社会精神压力大，不健康的生活方式等因素，造成我国的恶性肿瘤发病率居高不下。据国家癌症中心发布的2017年的中国肿瘤的现状和趋势报告显示：目前中国肿瘤发病率居前五位的依次为：肺癌、胃癌、肝癌、食道癌和结直肠癌。肺癌、乳腺癌分别居中国男性、女性发病首位。因此癌症正在严重威胁到世界人民和中国人民的健康。湖北贝母中主要活性部分是生物碱，近几年对于其逆转癌细胞多药耐药，抗胆碱活性，胆碱酯酶抑制活性等相关研究较多，但抗肿瘤方面研究较少。先前的研究发现部分异甾体生物碱具有抗肿瘤的活性，如贝母素甲可抑制mcf-7/tam(耐三苯氧胺人乳腺癌细胞)及aml-kg-1a(急性髓系白血病细胞)的增殖，并可诱导其凋亡。但是其活性均较低，在我们对湖北贝母的研究过程中发现了一类特殊的d/e环顺式的瑟文型异甾体生物碱成分，这类成分具有特征的c-5、c-6双键结构，它们具有明显的抗肿瘤活性，对此我们展开了研究，以其获取更多更有效的治疗肿瘤的活性物质，为临床应用提供更多有效的抗肿瘤药物。
技术实现要素：
本发明的目在于提供一类具有抗肿瘤活性同时含有特征的c-5、c-6双键结构、特殊的d/e环顺式的瑟文型异甾体生物碱及其衍生物的制备方法。
本发明的技术方案如下：
如式i所示异甾体生物碱的制备方法，包括如下步骤：
湖北贝母粗粉用溶剂提取，减压浓缩得到总浸膏，总浸膏用酸水分散后静置，上清液调节ph至大于9，用有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经过分离得到所述的化合物式i化合物。
本发明还提供另一种制备式i化合物的方法，包括如下步骤：
1)湖贝甲素(hupehenine)的3位羟基用硅基保护得到化合物2；
2)化合物2脱水得到化合物3；
3)化合物3脱保护得式i化合物
作为优选，步骤1)包括：在有机碱和4-二甲氨基吡啶存在下，湖贝甲素(hupehenine)与硅基化试剂反应，得到化合物2，所述硅基化试剂选自：叔丁基二甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷或叔丁基二苯基氯硅烷。
作为优选，步骤3)包括在盐酸、氢氟酸，吡啶氢氟酸盐、四丁基氟化铵或氟化铯的存在下脱保护得式i化合物。
作为优选，步骤2)包括将化合物2和4-二甲氨基吡啶溶于干燥吡啶中与三氯氧磷反应得到化合物3。
本发明还提供式ii化合物的制备方法，包括如下步骤：
式i化合物与羧酸、酸酐或酰氯反应生成式ii化合物，
其中，r1选自：-c(o)r2或-s(o)2r3；
r2选自c1-c6烷基或任选被一个或多个r4取代如下基团：c5-c10杂芳基或c6-c10芳基；
r3选自c1-c6烷基或任选被一个或多个r4取代的c6-c10芳基；
r4选自c1-c6烷基或卤素。
作为优选，r2选自c1-c6烷基、c5-c10杂芳基或任选被一个或多个r4取代的c6-c10芳基。
作为优选，r3选自任选被一个或多个r4取代的c6-c10芳基；更选优被c1-c6烷基或卤素取代的苯基。
本发明还提供式iii化合物的制备方法，包括如下步骤：
式i化合物与二氯亚砜发生取代反应得到式ii化合物；
本发明还提供式v化合物的制备方法，包括如下步骤：
式i化合物与对甲苯磺酰氯反应生成式iv化合物，式iv化合物与叔丁醇钾反应生成式v化合物；
术语定义和解释：
除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。
术语“c1-c6”应理解为优选表示具有1-6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。
术语“c6-c10芳基”是指含有6至10个碳原子的衍生至芳烃的基团。此类基团的实例包括但不限于苯基、苄基、萘基。
术语“c5-c10杂芳基”是指在其环中含有5至10个碳原子并含有1至4个各自独立地选自o、s和n的杂原子的芳族杂环基团。条件是所述基团的环上不含两个相邻的o原子或两个相邻的s原子。该杂环基团包括苯并稠环体系。c5-c10杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、呋喃基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、二氮杂萘基、异吲哚基、嘌呤基、苯并噻吩基、苯并噻唑基。
具体实施方式
实施例1：cw-1的制备
1)将干燥的湖北贝母(fritillariahupehensishsiaoetk.c.)打成粗粉后，80％乙醇加热回流提取2次，每次3h。将两次的提取液合并后减压浓缩，得到总浸膏；
2)向总浸膏中先加入3％的盐酸溶液使其酸化，充分搅拌后静置，取上清液，氨水碱化至ph值大于9。用水饱和后的石油醚(10l×3)，石油醚/醋酸乙酯(1:1，10l×3)以及醋酸乙酯(10l×3)对碱液依次分段萃取；
3)水饱和的石油醚萃取部分的生物碱，以环己烷/醋酸乙酯/二乙胺通过正相硅胶色谱柱反复分离纯化得到cw-1(湖贝丙素)。
湖贝丙素氢碳谱数据：
实施例2：cw-2的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(140μl,1mmol),醋酐(66μl,0.7mmol)，4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)，该反应在室温下搅拌5h。tcl监测反应完全后，向反应液中加水淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的nahco3洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物200.7mg，产率91％。esi-ms,m/z:440.20[m+h]+
实施例3：cw-3的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入正丁酸(91μl,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应2h。tcl监测反应完全后，加10％的nahco3溶液搅拌淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nacl2洗两遍，再用h2o2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物210.5mg，产率90.1％。esi-ms,m/z:468.20[m+h]+
实施例4：cw-4的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水的ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(280μl,2mmol),三甲基乙酰氯(123μl,1mmol)，4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)，反应溶液在氮气的保护下，室温下反应5h。tcl监测反应完全后，向反应液中加水淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nahco3洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝4:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物211.2mg，产率87.7％。esi-ms,m/z:482.30[m+h]+
实施例5：cw-5的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入正己酸(179μl,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应2h。tcl监测反应完全后，加10％的nahco3溶液搅拌淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nacl2洗两遍，再用h2o2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物221.7mg，产率89.5％。esi-ms,m/z:496.30[m+h]+。
实施例6：cw-6的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入2-噻吩甲酸(128mg,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应3.5h。tcl监测反应完全后，加10％的nahco3溶液搅拌淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nacl2洗两遍，再用h2o2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物231.4mg，产率91.2％。esi-ms,m/z:508.20[m+h]+
实施例7：cw-7的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入2-呋喃羧酸(112mg,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应6h。tcl监测反应完全后，加10％的nahco3溶液搅拌淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nacl2洗两遍，再用h2o2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物223.5mg，产率91％。esi-ms,m/z:492.20[m+h]+。
实施例8：cw-8的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水的ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(280μl,2mmol),苯甲酰氯(116μl,1mmol)，4-二甲氨基吡啶(dmap,12mg,0.1mmol)，反应溶液在氮气的保护下，室温下反应过夜。tcl监测反应完全后，向反应液中加水淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nahco3洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝5:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物238.2mg，产率95％。esi-ms,m/z:502.20[m+h]
实施例9：cw-9的制备
称取cw-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水的ch2cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(280μl,2mmol),对甲基苯磺酰氯(286mg,1.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(dmap,60mg,0.5mmol)，反应溶液在氮气的保护下，室温下反应过夜。tcl监测反应完全后，向反应液中加10％nahco3淬灭反应。反应液加h2o2和ch2cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并ch2cl2层，用1:1的饱和nacl洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱剂比例为石油醚：丙酮＝8:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物238.2mg，产率95％。esi-ms,m/z:552.20[m+h]+。
实施例10：cw-10的制备
取化合物cw-9(300mg,0.53mmol)10ml圆底烧瓶，加入干燥的苯(1.59ml)，再加入dmso(2.65ml)，在氮气保护下加入叔丁醇钾(500mg，5.3mmol)，60℃下反应1h，tlc检测反应完全，原料消失。用饱和nahco3淬灭，ea萃取三次，ea层分别经饱和食盐水和水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂。粗品经过硅胶柱层析纯化，洗脱剂比例为pe：ea＝7:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物化合物176mg，产率85％。esi-ms,m/z:380.20[m+h]+。
实施例11：cw-11的制备
取化合物cw-1(200mg,0.5mmol)溶于干燥的ch2cl2(5ml)中，在0℃下缓慢滴加二氯亚砜(socl2，0.36ml，5mmol)，加完后，反应液移至室温，在氮气的保护下反应3h，tlc检测反应完全，原料消失。向反应液中滴加饱和nahco3至无气泡产生，分层萃取，水层用ch2cl2萃取两次，合并有机相，有机层分别经饱和食盐水和水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂。粗品经过硅胶柱层析纯化，洗脱剂比例为pe：ea＝10:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物200mg，产率96％。esi-ms,m/z:416.10[m+h]+
生物活性试验
1、抗人非小细胞肺癌细胞(a549)增殖活性试验
1)试验材料：本发明实施例的化合物、贝母中常见的异甾体生物碱、5-氟尿嘧啶及人非小细胞肺癌细胞(a549)
2)癌细胞株培养
将a549细胞置于10％的fbs、1％的青霉素、1％的链霉素的dmem培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，移去就培养基，加pbs清洗，再用2.5％的胰蛋白酶消化3min，加入含血清的培养基终止消化，用枪头将细胞由培养瓶低吹打下来，1200r/min下离心3min去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用于实验。
3)a549细胞的体外抗肿瘤活性实验
a实验分组及药物处理
本实验各个测试化合物都分为8个组，其中包括6个给药组，1个对照组，和1个空白组。
b接种癌细胞于96孔板
选用对数生长期的癌细胞，经胰蛋白酶消化完成后将a549细胞从瓶底吹打下来，转移到离心管中，1200r/min下离心3min去除培养基，每孔株加入对应的培养基配制成5×104/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加pbs，不接细胞，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱培养24h。
c给药于96孔板
细胞铺板24h后即可进行细胞给药，对照组与调零组分别加入不含药物，含有对应溶解药物的溶剂的的培养基100μl，实验组加入不同药物浓度梯度的培养液100μl，每个剂量设6个平行孔，给完药后在5％co2，37℃的饱和湿度的无菌恒温箱中培养48h。
d比色法实验
培养48h，孔加入20ul新鲜配制的5mg/ml的mtt无菌溶液，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150uldmso溶解紫色结晶沉淀，将96孔板放在摇床上避光慢速、水平震荡10min，然后用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光值。
计算各个浓度下的生长抑制率，gi(生长抑制率)＝1-药物对照组od值/对照组od值×100％，其中各项od值均已扣除空白组实验值。本实验以5-氟尿嘧啶(5-fu)为阳性对照，每个化合物重复三次取平均值，实验结果用平均值±标准偏差表示
表1化合物的给药浓度及ic50
从表1可知，本发明的化合物抗人非小细胞肺癌细胞(a549)增殖活性明显高于其他贝母衍生物及阳性对照5-氟尿嘧啶。
2、抗白血病k562细胞株增殖活性试验
1)试验材料：本发明实施例的化合物、贝母中常见的异甾体生物碱、三尖杉酯碱及人慢性髓系白血病细胞株(k562)
2)癌细胞株培养
将k562细胞置于10％的fbs、1％的青霉素、1％的链霉素的rpmi-1640培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，将细胞用枪头吹打下来，1200r/min下离心3min去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用于实验。
3)k562细胞的体外抗肿瘤活性实验
a实验分组及药物处理
本实验各个测试化合物都分为8个组，其中包括6个给药组，1个对照组，和1个空白组。
b接种癌细胞于96孔板
选用对数生长期的癌细胞，将k562细胞从瓶底吹打下来后，转移到离心管中，1200r/min下离心3min去除培养基，每孔株加入对应的培养基配制成5×104/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加pbs，不接细胞，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱培养24h。
c给药于96孔板
细胞铺板24h后即可进行细胞给药，对照组与调零组分别加入不含药物，含有对应溶解药物的溶剂的的培养基100μl，实验组加入不同药物浓度梯度的培养液100μl，每个剂量设6个平行孔，给完药后在5％co2，37℃的饱和湿度的无菌恒温箱中培养48h。
d比色法实验
培养48h，孔加入20ul新鲜配制的含5mg/mlmtt的无菌溶液，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150uldmso溶解紫色结晶沉淀，将96孔板放在摇床上避光慢速、水平震荡10min，然后用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光值。
计算各个浓度下的生长抑制率，gi(生长抑制率)＝1-药物对照组od值/对照组od值×100％，其中各项od值均已扣除空白组实验值。本实验以三尖杉酯碱为阳性对照，每个化合物重复三次取平均值，实验结果用平均值±标准偏差表示(x±s)。
表2化合物的给药浓度及ic50
从表2可知，本发明的化合物抗白血病k562细胞的增殖活性明显高于作为对照的其他贝母衍生物。
3、抗人髓状甲状腺导管肿瘤细胞(tt)增值活性试验
1)试验材料：本发明实施例的化合物、贝母中常见的异甾体生物碱、5-氟脲嘧啶及人髓状甲状腺导管肿瘤细胞(tt)
2)癌细胞株培养
将tt细胞置于10％的fbs、1％的青霉素、1％的链霉素的dmem培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，移去就培养基，加pbs清洗，再用2.5％的胰蛋白酶消化3min，加入含血清的培养基终止消化，用枪头将细胞由培养瓶低吹打下来，1200r/min下离心3min去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用于实验。
3)tt细胞的体外抗肿瘤活性实验
a实验分组及药物处理
本实验各个测试化合物都分为9个组，其中包括7个给药组，1个对照组，和1个空白组。
b接种癌细胞于96孔板
选用对数生长期的癌细胞，经胰蛋白酶消化完成后将tt细胞从瓶底吹打下来，转移到离心管中，1200r/min下离心3min去除培养基，每孔株加入对应的培养基配制成2×104/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加pbs，不接细胞，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱培养24h。
c给药于96孔板
细胞铺板24h后即可进行细胞给药，对照组与调零组分别加入不含药物，含有对应溶解药物的溶剂的的培养基100μl，实验组加入不同药物浓度梯度的培养液100μl，每个剂量设6个平行孔，给完药后在5％co2，37℃的饱和湿度的无菌恒温箱中培养48h。
d比色法实验
培养48h，孔加入20ul新鲜配制的5mg/mlmtt的无菌溶液，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150uldmso溶解紫色结晶沉淀，将96孔板放在摇床上避光慢速、水平震荡10min，然后用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光值。
计算各个浓度下的生长抑制率，gi(生长抑制率)＝1-药物对照组od值/对照组od值×100％，其中各项od值均已扣除空白组实验值。本实验以5-氟尿嘧啶为阳性对照，每个化合物重复三次取平均值，实验结果用平均值±标准偏差表示
表3化合物的给药浓度及ic50
从表3可知，本发明的化合物人髓状甲状腺导管肿瘤细胞(tt)增殖活性明显高于其他贝母衍生物及阳性对照5-氟尿嘧啶。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。