一种特异性结合Taq酶的核酸适配体及其筛选方法、应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种特异性结合taq酶的核酸适配体及其筛选方法、应用。
背景技术：
：taqdna聚合酶(thermusaquaticusdnapolymerase)，简称taq酶，是从水生栖热菌中分离出的具有热稳定性的dna聚合酶，此菌于1969年由brock分离自美国黄石公园温泉，其生长温度为70-75℃，1985年，r.k.saiki等将分离纯化后的taqdna聚合酶应用于pcr反应，对于pcr的应用有里程碑的意义。pcr循环包括变性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右)，每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使pcr技术变得非常简捷，得以大量应用，同时也大大降低了成本。现该酶广泛应用于疾病诊断与治疗、传染病检测、药物作用机理等医药领域。taqdna聚合酶在75-80℃时活性最高，但是在温度较低时，taq酶的活性依然存在，这就会使得在pcr反应的初始阶段，由于引物的量比模板的量高出很多，在仪器升温过程中，容易出现引物互搭或引物和模板会有一些非特异性配对的现象，在taqdna聚合酶的作用下延伸，形成引物二聚体和非特异性产物，这些非特异性产物又可作为模板在以后的pcr循环里继续扩增，这样非特异性产物不断扩增积累，就会严重干扰目的片段的扩增从而导致目的产物扩增效率低，甚至导致特异性条带不能扩出。为了避免升温过程中产生引物二聚体和非特异性产物，根据pcr体系的反应特点及关键成分设计了多种方案以实现pcr的热启动。目前，应用最多的就是通过抗体修饰来实现taq酶的热启动。在低温时，抗体与酶形成抗原-抗体复合物，taq酶活性被封闭。当pcr反应温度大于70℃时，抗体变性从而与taq酶分离，taq酶活性得以释放，实现热启动pcr。但温度降低，抗体变性无法复性，不能实现抑制taq酶活性作用。用核酸适配体制备的热启动taq酶与常规意义上的抗体结合的热启动酶有所不同，当温度升高时核酸适配体变性，与taq酶解离，从而taq酶可以发挥活性，当温度降低到约45℃，核酸适配体复性后可以重新与taq酶结合，从而抑制它的活性，因此它的热启动并不仅仅是反应初始的升温阶段的热启动，而是整个pcr的每个循环中的热启动。核酸适配体与抗体相比稳定性更好，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。目前，在我国有关研究热启动dna聚合酶的报道文章还不是很多，核酸适配体与taq酶结合来制备热启动taq酶的报道更少见。技术实现要素：基于
背景技术：
存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合taq酶的核酸适配体及其筛选方法、应用，本发明可以与taq酶特异性结合，抑制taq酶的活性，且本发明筛选效率高。本发明提出的一种特异性结合taq酶的核酸适配体，所述核酸适配体序列至少含有a序列、b序列中的一种，其中，a序列包含以下四种序列中的至少一种：1)、如seqidno.1所示的dna序列；2)、与seqidno.1所示dna序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合taq酶的dna序列；3)、在严格条件下与seqidno.1所示dna序列杂交的dna序列；4)、由seqidno.1所示dna序列转录的rna序列；b序列包含以下四种序列中的至少一种：1)、如seqidno.2所示的dna序列；2)、与seqidno.2所示dna序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合taq酶的dna序列；3)、在严格条件下与seqidno.2所示dna序列杂交的dna序列；4)、由seqidno.2所示dna序列转录的rna序列。优选地，上述与seqidno.1所示dna序列具有同源性，且能够特异性结合taq酶的dna序列，其同源性可以为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。优选地，上述与seqidno.2所示dna序列具有同源性，且能够特异性结合taq酶的dna序列，其同源性可以为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶。本发明还提出了上述特异性结合taq酶的核酸适配体的筛选方法，如seqidno.1、seqidno.2所示的dna序列的筛选方法包括如下步骤：以taq酶为靶标物质，经磁珠筛选和spr-selex筛选交替筛选得到。上述磁珠筛选和spr-selex筛选不分先后顺序，可随机交替筛选。上述交替筛选的交替方法为：1-4轮spr-selex筛选和1-4轮磁珠筛选交替进行筛选。上述磁珠筛选方法和spr-selex筛选方法均为本领域常规筛选方法。磁珠筛选方法包括如下步骤：a、将磁珠经活化处理后与靶标物质偶联，然后与随机核酸文库孵育、清洗、分离得到一级文库；b、取一级文库进行pcr扩增，然后制备dna单链文库。spr-selex筛选方法包括如下步骤：a、将靶标物质偶联到芯片上，然后封闭芯片上的非特异性位点，接着进样随机核酸文库孵育，分离得到一级文库；b、取一级文库进行pcr扩增，然后制备dna单链文库。上述磁珠筛选方法、spr-selex筛选方法中，a-b为一轮筛选，用前一轮筛选得到的dna单链文库替换a中的随机核酸文库，进行下一轮筛选，经多轮筛选即可得到目标序列。本发明还提出了一种核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是上述核酸适配体改造成的肽核酸。硫代磷酸酯修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。肽核酸(peptidenucleicacids，pna)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与dna相同。pna可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。本发明还提出了上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物在抑制taq酶活性中的应用。上述b序列所对应的核酸适配体或上述b序列所对应的核酸适配体衍生物可以通过抑制taq酶的活性，应用于taq酶热启动pcr反应中。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明筛选的方法结合了磁珠筛选和spr-selex筛选，避免了单一筛选方法带来的非特异性结合核酸的不断积累，筛选效率更高；通过筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性且能够合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且更稳定，易于保存。采用本发明替代抑制taq酶活性的抗体，可在常温下抑制taq酶活性，从而有效控制pcr反应初始阶段由于引物互搭或与模板中一些非靶位点错配形成引物二聚体或非特异性产物的产生。附图说明图1为本发明的核酸适配体与taq酶的亲和力检测数据图，其中，序列1为如seqidno.1所示序列的核酸适配体，序列2为如seqidno.2所示序列的核酸适配体。图2为本发明的核酸适配体与taq酶相互结合修饰后进行热启动pcr的结果图，其中，序列1为如seqidno.1所示序列的核酸适配体，序列2为如seqidno.2所示序列的核酸适配体。具体实施方式下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。实施例1特异性结合taq酶的核酸适配体的筛选1.合成以下序列所示的随机单链dna文库：随机单链dna文库：5’-fam-agcagcacagaggtcagatg-(40n)-cctatgcgtgctaccgtgaa-3’，其中，“40n”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。2.spr-selex筛选：2.1偶联：用naoh水溶液清洗芯片2遍，每遍以20μl/min的流速进样40μl进行清洗；然后以10μl/min的流速向芯片进样20μlnaoh水溶液，再以5μl/min的流速向芯片进样50μl溶液a活化芯片，接着以5μl/min的流速向芯片进样80μltaq酶溶液，再以5μl/min的流速向芯片进样50μl乙醇胺封闭芯片，最后以5μl/min的流速向芯片进样30μl鲑鱼精dna水溶液结合taq酶上的非特异性位点得到偶联taq酶芯片；其中，naoh水溶液的浓度为50mm，且含有质量分数为0.05％的sds；溶液a为0.4medc水溶液和0.1mnhs水溶液的等体积混合液；taq酶溶液的浓度为50μg/ml，其溶剂为ph＝4.0的10mm醋酸钠水溶液；鲑鱼精dna水溶液的浓度为1mg/ml；2.2孵育：以步骤1中的随机单链dna文库为起始文库，用结合缓冲液taqbuffer稀释溶解1od步骤1中的随机单链dna文库至浓度为10μm，沸水煮10min使折叠的链解开，然后自然冷却至室温，缓慢复性让dna链重新折叠成不同的二级结构得到随机单链dna文库溶液；以2μl/min的流速向偶联taq酶芯片进样120μl的随机单链dna文库溶液，使随机单链dna文库流经偶联taq酶芯片表面，然后用结合缓冲液以10μl/min的流速洗涤30min，将未结合的随机单链dna文库洗掉得到孵育芯片；其中，结合缓冲液taqbuffer的配方为20mmhepes，150mmnacl，1mmkcl，1mmcacl2，1mmmgcl2，ph＝7.4；2.3分离：取孵育芯片，用少于5μl的naoh水溶液洗脱结合在芯片表面的单链dna得到一级文库洗脱液；naoh水溶液与2.1中的naoh水溶液相同；2.4pcr扩增：以一级文库为模板进行两步扩增，将步骤2.3中的全部一级文库洗脱液与5倍体积的乳浊液混匀后，按50μl/管分装到扩增管中，进行pcr扩增，扩增25个循环得到一步扩增产物，经正丁醇纯化得到一步扩增产物溶液；一步扩增产物溶液与2mlpcrmix混匀，按50μl/管分装到扩增管中，进行pcr扩增，扩增18个循环得到二步扩增产物，用乙醇沉淀得到二步扩增产物溶液；pcr扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；乳浊液为100μlpcrmix与1ml矿物油混匀即得；其中，扩增得到一步扩增产物、二步扩增产物若不立即使用，可于4℃保存；2.4.1正丁醇纯化步骤：取装有一步扩增产物的扩增管，每管加50μl正丁醇混匀后，收集正丁醇，然后用100μl正丁醇再洗一次扩增管，合并正丁醇，14000rpm离心10min，弃上清；向沉淀中加入约1.5ml正丁醇混匀，14000rpm离心10min，弃上清；向沉淀中加入1.5ml的无水乙醇，漩涡震荡后，14000rpm离心5min，弃上清，将沉淀65℃烘干，加入100μl1×taqbuffer溶解得到一步扩增产物溶液；2.4.2乙醇沉淀步骤：将二步扩增产物分装在5个2ml的ep管中，每管400μl，分别加入40μl乙酸钠混匀，再分别加入800μl预冷的无水乙醇混匀，于-80℃保温1h，12000g离心10min，弃上清液；向沉淀中加750μl70％乙醇水，12000g离心2min，弃上清液，将沉淀烘干，加200μl1×taqbuffer溶解沉淀得到二步扩增产物溶液；矿物油配方如下：物质添加量2％(v/v)abilem901ml0.05％tritonx-100(#t-9284,sigma)25μlmineraloil(#m-3516,sigma)至50mlpcrmix配方如下：物质添加量ddh2o86.6μl10×pfu聚合酶buffer10μldntp(10mm)2μl正向引物(100μm)0.5μl反向引物(100μm)0.5μlpfu(5u/μl)0.4μl总体系100μl正向引物：5’-fam-agcagcacagaggtcagatg；反向引物：5’-(20a)-link-ttcacggtagcacgcatagg；2.5制备dna单链文库：将2.4.2得到的二步扩增产物溶液与tbe/尿素变性缓冲液按体积比1：1混匀，沸水浴15min，接着冰浴3min，然后进行变性page胶电泳，电泳电压为400v，电泳时间约为20min，使加长的一条单链dna与fam标记的单链dna分开，切取含有fam标记的单链dna的胶条，将胶条捣碎，加入1mlddh2o，水浴将fam标记的单链dna转移至溶液中，离心留上清，再用试剂盒(上海生工sk1144)纯化得到fam标记的单链dna；电泳凝胶配方如下：总体积10ml尿素4.2gddh2o2.5ml40％聚丙烯酰胺2ml5×tbe2ml10％aps60μltemed15μl3磁珠筛选：3.1偶联：取20μl磁珠用水清洗干净，与溶液a孵育15min，活化磁珠；然后与taq酶溶液混匀，置于垂直混合仪上孵育30min，然后置于磁力架上，弃上清并立即向磁珠中加入100μl乙醇胺溶液，反应10min以封闭磁珠表面未反应的活化位点，置于磁力架上，弃上清，磁珠用1×taqbuffer清洗3次得到偶联taq酶磁珠；其中，溶液a与2.1中的溶液a相同；taq酶溶液的浓度为50μg/ml，其溶剂为ph＝5.0的10mm醋酸钠水溶液；乙醇胺溶液的浓度为1m，用盐酸ph＝8.5；3.2孵育和清洗：以步骤2中得到的fam标记的单链dna为起始文库，用130μl结合缓冲液1×taqbuffer稀释溶解1od步骤2中得到的fam标记的单链dna至浓度为10μm，沸水煮10min使折叠的链解开，然后自然冷却至室温，缓慢复性让dna链重新折叠成不同的二级结构，然后与2μl偶联taq酶磁珠混匀，于垂直混合仪上孵育1h，于磁力架上，保留磁珠弃上清，用1×taqbuffer清洗磁珠6-8次，每次用量为50μl得到孵育磁珠；3.3分离：将孵育磁珠用沸水煮沸10min，收集上清得到次级文库洗脱液；3.4pcr扩增：以次级文库为模板进行两步扩增，操作同2.4；3.5制备dna单链文库：操作同2.5，得到fam标记的单链dna；4多轮交替筛选：以步骤2.5或步骤3.5中得到的fam标记的单链dna为起始文库，代替步骤2.2或步骤3.2中的起始文库，按照spr-selex筛选和磁珠筛选的方法，进行交替重复筛选，每次操作均以前一次操作中得到的fam标记的单链dna为起始文库，筛选过程中检测fam标记的单链dna对taq酶识别能力的变化；直至fam标记的单链dna对taq酶的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，得到若干条单链dna的序列，并经人工合成得到若干条单链dna，分别检测这几条合成的序列与taq酶的结合能力，有亲和力的即为核酸适配体；其中，在交替筛选过程中，在spr-selex筛选过程中即可观察到单链dna对taq酶的识别能力；在磁珠筛选过程中，借助流式细胞仪检测单链dna对taq酶的识别能力；磁珠筛选过程中，流式细胞仪检测方法为：按步骤3.1制得偶联taq酶磁珠，然后将每一轮获得的fam标记的单链dna用结合缓冲液1×taqbuffer稀释至浓度为1μm，分别与偶联taq酶磁珠孵育60min，用结合缓冲液1×taqbuffer清洗2次，用流式细胞仪检测亲和力。实施例2与taq酶亲和力的检测：取实施例1合成的若干条单链dna即核酸适配体，每条核酸适配体均用结合缓冲液1×taqbuffer配制成浓度分别为1μm、0.5μm、0.25μm、0.05μm的4份溶液；按步骤2.1制得偶联taq酶芯片，取4份溶液向偶联taq酶芯片依次进样，按spr方法检测每条核酸适配体与taq酶的亲和力，发现若干条核酸适配体中，如seqidno.1、seqidno.2所示序列的核酸适配体与taq酶的亲和力好，结果参照图1，图1为本发明的核酸适配体与taq酶的亲和力检测数据图，其中，序列1为如seqidno.1所示序列的核酸适配体，序列2为如seqidno.2所示序列的核酸适配体；由图1可以看出如seqidno.1、seqidno.2所示序列的核酸适配体与taq酶的亲和力好，spr检测得到的解离常数均为nm级别，可用于特异性结合taq酶从而抑制其活性。seqidno.1所示的序列为：5’-agcagcacagaggtcagatgaccgggaggcaccattgtgactattccaacgttttagtcctatgcgtgctaccgtgaa-3’；seqidno.2所示的序列为：5’-agcagcacagaggtcagatgacgcgtccagtctctacctgagccggatcataccaatgatcctatgcgtgctaccgtgaa-3’。实施例3taq酶核酸适配体在热启动pcr中的应用：分别用如seqidno.1、seqidno.2所示序列的核酸适配体配制pcr反应体系，于25℃放置10min使得taq酶被核酸适配体结合修饰，然后加入高浓度模板进行特异性检测，反应体系配方如下：物质添加量5×pcrbuffer(mg2+plus)10μldntp(2.5mmeach)1μltemplatedna0.5μlprimeri(20μm)0.2μlprimerii(20μm)0.2μltaqdnapolymerase(5u/μl)2.5μlaptamer15pmolddh2oupto50μlpcr反应条件如下：将反应结束后的样品用琼脂糖电泳检测，检测结果参照图2，图2为本发明的核酸适配体与taq酶相互结合修饰后进行热启动pcr的结果图，其中，序列1为如seqidno.1所示序列的核酸适配体，序列2为如seqidno.2所示序列的核酸适配体；由图2可以看出，如seqidno.1所示序列的核酸适配体可以完全抑制taq酶的活性，导致没有目的条带扩增，可以用于永久的抑制taq酶活性；taq酶被如seqidno.2所示序列的核酸适配体结合修饰后，有目的条带扩增，并且引物二聚体亮度明显低于目的条带即未修饰的taq酶的亮度，可用于taq酶的热启动pcr。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司<120>一种特异性结合taq酶的核酸适配体及其筛选方法、应用<130>2018<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>78<212>dna<213>人工合成(1)<400>1agcagcacagaggtcagatgaccgggaggcaccattgtgactattccaacgttttagtcc60tatgcgtgctaccgtgaa78<210>2<211>80<212>dna<213>人工合成(2)<400>2agcagcacagaggtcagatgacgcgtccagtctctacctgagccggatcataccaatgat60cctatgcgtgctaccgtgaa80当前第1页12