木薯U6启动子基因及应用的制作方法

本发明属生物技术领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及木薯u6启动子的克隆和应用。

背景技术：

木薯(manihotesculentacrantz)属大戟科(euphorbiaceae)木薯属(manihotp.mill.)植物，是世界三大薯类(木薯、甘薯和木薯)作物之一，同时也是热带地区继水稻、玉米、高粱之后的第四大粮食作物，是热带和亚热带地区重要的热能来源，为世界上近6亿人提供食物。木薯广泛分布于全球南、北纬30°之间的热带及部分亚热带地区。我国木薯主产区有海南、广东、广西、福建、云南，在四川、贵州、湖南、江西、浙江等地也有种植。木薯对光、热和水资源的利用非常高，单位面积生物能产量几乎高于其它栽培作物，具有抗旱、耐贫瘠、适应性广以及储藏根(块根)淀粉含量高(占干重的85％)等独特而优良的生物学特性。木薯淀粉是食品加工、工业变性淀粉、饲料和生物质产品(燃料乙醇)的重要原料。木薯已有几千年的栽培历史，因植株基因型高度杂合、基因冗余、花粉育性低、有性子代严重分离等自身特征和种质资源的局限性，其常规育种困难且进展较慢。

近年来，通过转基因途径改良木薯品种获得阶段性进展，例如在降低氰化物、提高块根淀粉含量、改良直(支)淀粉比例以及抗病、耐寒、抗旱转基因育种都取得良好进展。尽管如此，木薯转基因育种仍然存在不少亟待解决的问题。其中，挖掘适合木薯本身的特异启动子。目前广泛用于木薯的启动子是camv35s，camv35s并不适宜驱动块根基因的表达。虽然已有马铃薯块茎patatin蛋白特意启动子、pt214等相继用于木薯转化，但相较于水稻、小麦等粮食作物，木薯自身的启动子资源相对匮乏。

u6启动子是二型启动子，与真核生物rna聚合酶iii结合后，负责转录u6rna，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。u6启动子+1位是鸟苷酸。rna聚合酶iii启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有u6启动子，u6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带polya尾的序列，由rna聚合酶iii聚合u6启动子转录产生shrna，经剪切后产生成熟sirna，产生干扰效果；shrna的表达量取决于启动子的强弱，与同类的rna聚合酶iii的启动子h1相比，u6启动子启动能力更强，表达时间也长。

目前，在转基因技术领域，u6启动子多用在构建rnai表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，u6启动子也被开始广泛用于crispr系统中sgrna引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。u6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的u6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人u6启动子有几个明显的特点：1、具有tatabox，位于-30～-25bp，被poliii转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在pse(proximalsequenceelement)，该元件是snrna激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在dse(distalsequenceelement)；4、启动子下游存在5'-tttt-3'序列为poliii提供转录终止信号；5、pse和dse之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的g对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用u6启动子构建rnai表达载体时，u6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变pse和dse的间距，同时保留tatabox和+1位的g，在下游应有5'-ttttt-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

木薯转基因研究对块根、块茎类植物生物技术的研究越来越重要，木薯u6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关技术领域的研究，具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供3个克隆的木薯u6启动子，并将这3个启动子与gus基因融合表达转化木薯胚性愈伤，通过瞬时表达验证了3个启动子能够在木薯上高效表达，为木薯及相近植物的转化研究提供了高效的启动子序列。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供木薯u6启动子基因，包括3个木薯u6启动子基因，分别具有序列表中seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3所示的核苷酸序列。

启动子序列seqidno:1、seqidno:2均来自于木薯chr_04染色体，启动子序列seqidno.3来自于chr_12染色体。

本发明的另一目的在于提供木薯u6启动子基因在转基因技术领域中的应用。

该3个启动子还包括含有如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示基因序列的其它序列。

本发明利用snrna序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥atu6启动子的snrna序列与木薯的基因组序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，pcr克隆出木薯的3个u6启动子，并构建与gus基因融合表达载体转化木薯胚性愈伤，gus染色瞬时表达验证表明，克隆出的3个木薯u6启动子在木薯上具有很强的启动效率，能在木薯上很好的启动gus基因的表达。

附图说明

图1：从木薯dna上克隆出3个u6启动子序列；

图2：从木薯n、o、p序列上pcr出构建gus融合表达载体具有粘性末端的3个u6启动子序列；

图3：用于转化的pzmubi-gus(zmubis-hph)质粒载体图；

图4：是用于转化的pmau6n-gus(mau6n-hph)质粒载体图；

图5：是用于转化的pmau6o-gus(mau6o-hph)质粒载体图；

图6：是用于转化的pmau6p-gus(mau6p-hph)质粒载体图；

图7：木薯胚性愈伤gus基因瞬时表达情况。ubi是对照载体pzmubi-gus(zmubis-hph)载体，n是pmau6n-gus(mau6n-hph)载体，o是pmau6o-gus(mau6o-hph)载体，p是pmau6p-gus(mau6p-hph)载体ck是空白对照；

图8：各处理均值比较图(5％显著水平)。

具体实施方式

木薯u6启动子的克隆和功能验证方法，其具体步骤如下：

1、利用u6启动子snrna序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥atu6启动子的snrna序列(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与木薯的基因组(manihotesculentav6.1)序列进行比对(blast)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(chr_04、chr_11、chr_12、chr_13)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/cgi/bw.cgi#！网站上对挑选出的序列进行boxshade(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的use位置和tata框位置。

2、木薯u6启动子的pcr克隆：在下载的u6启动序列use和tata框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物对。然后以木薯华南8号品系dna为模版，pcr克隆目标启动序列，pcr后跑胶观察，回收通过pcr克隆出的目标条带进行测序比对。最后能克隆出启动子序列，测序后符合预期启动序列的启动子序列位于chr_04、chr_12染色体的不同位置上，克隆出启动子序列的位置、引物对及序列大小(见表1，图1)。pcr试剂购于bbi生命科学有限公司，反应条件：95℃5min，94℃30s，53℃45s，72℃1min，32循环，72℃5min，4℃保存。

表1：克隆出木薯3个u6启动子的引物序列及克隆位置与大小

3、木薯u6启动子与gus基因融合植物表达载体构建：以带gus基因的pzmubi-gus(zmubis-hph)质粒(见图2)为骨架质粒(hygr植物筛选基因，kanr菌落筛选基因)，质粒由美国donalddanforthplantsciencecenter的thomasp.brutnell实验室提供；以表1克隆的n、o、pu6启动子序列为模版，设计带骨架质粒gus基因启动子粘性末端的引物对(见表2)pcr克隆目标启动子序列，通过酶切连接将质粒gus基因前的zmubi启动子替换为克隆的木薯u6启动子，构建木薯u6启动子与gus基因融合植物表达载体。融合植物表达载体通过dna测序检测目标启动序列构建情况。pcr使用北京博迈德生物技术有限公司的2×taqpcrmastermix，反应条件：94℃3min，94℃30s，50℃30s，72℃1min，34循环，72℃5min，4℃保存。

表2从cassava12(n)、cassava04(o)、cassava04(p)启动子序列上克隆产物pcr目标启动子序列到gus基因融合植物表达载体上的引物对

4、木薯u6启动子农杆菌转化验证：将对照质粒pzmubi-gus(zmubis-hph)(图3)，木薯u6启动子与gus基因融合植物表达载体pmau6n-gus(mau6n-hph)(图4)，pmau6o-gus(mau6o-hph)(图5)，pmau6p-gus(mau6p-hph)(图6)转化到农杆菌agl1菌株，以木薯幼叶胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养5天后取出胚性愈伤进行gus染色观察，从gus基因的gus染色表达情况评估克隆的u6启动子的启动能力和表达活性。gus染色液按照常规方法配制x-gluc母液和x-gluc基液，然后按比例混合后储存于4℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入gus染色液中37℃过夜染色，倒掉染色液，70％酒精脱色1～3次，95％的酒精脱色1～2次，观察gus染色情况(见图7)。最后收集胚性愈伤在体视显微镜下观察拍照。同时，取同等重量的每种愈伤gus染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值(见表3)，各处理均值比较见图8。数据、图标处理在excel2010下进行，通过sigmaplot10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。从分析结果可知，目标载体启动子p与ubi、n、o启动子启动能力差异极显著，启动能力弱于ubi、n、o启动子，ubi、n、o启动子间没有极显著差异；o启动子与ubi启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力相当；n启动子与ubi启动子在5％和10％显著水平都有显著差异，启动能力稍弱；o启动子与n启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力稍强。

表3染色液od620测定

备注：目标载体启动子p与ubi、n、o启动子启动能力差异极显著，启动能力弱于ubi、n、o启动子，ubi、n、o启动子间没有极显著差异；o启动子与ubi启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力相当；n启动子与ubi启动子在5％和10％显著水平都有显著差异，启动能力稍弱；o启动子与n启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力稍强。

本发明第一次克隆了木薯u6启动子，并在木薯上验证了其启动功能，为木薯及相近物种转基因研究提供了很好的启动子工具。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>木薯u6启动子基因及应用

<160>3

<210>1

<211>214

<212>dna

<213>木薯（manihotesculentacrantz）的u6启动子基因序列

<400>1

tccccattcttcatccaacattattctatacaaggctaaacaaatatagctagaaattgg60

gcctcatgataaattgggctgtagcccatagagagtctaaaacttgctaggtgcagcctt120

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<210>2

<211>628

<212>dna

<213>木薯（manihotesculentacrantz）的u6启动子基因序列

<400>2

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<211>484

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<213>木薯（manihotesculentacrantz）的u6启动子基因序列

<400>3

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