一种大量提取转化粪便DNA的方法与流程

本发明涉及一种大量提取转化粪便dna的方法。

背景技术：

大肠癌包括结肠癌与直肠癌，是常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌，已高居世界恶性肿瘤第3位病死率第4位。有资料显示早期大肠癌术后5年存活率高达90％，而晚期大肠癌术后5年存活率只有10％，因此大肠癌的早筛显得尤为重要。目前早筛查措施主要包括粪便潜血实验，钡灌肠检查、肠镜检查等，但是肠癌早期无明显症状且缺乏高灵敏度和强特异性的早期诊断技术，大部分患者被确诊时已是肠癌中晚期，失去了最佳的治疗时机，因此建立早期肠癌无损伤快速诊断方法成为了当前医学界重点攻克难题。

研究表明，正常人的粪便每天大约可排泄约10¹⁰个上皮细胞，提取脱落到粪便里的结肠黏膜细胞的dna，再通过转化技术，将未甲基化的胞嘧啶高效转化成尿嘧啶，最后检测基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，是一种理想的早期结直肠癌筛查手段。

粪便样品获得比较容易，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。另外使用样本量少，取样过程非常方便且对病人无任何影响。但是目前应用于临床诊断还有诸多困难需要解决，比如采集和分离过程中存在dna酶的降解，各种抑制剂的存在导致从粪便里提取出的人类粪便dna量很少或提取的dna难以用于pcr扩增。

目前市面上，已有相关粪便dna提取方法，但是提取获得的粪便dna量少或dna难以用于pcr扩增，另外存在操作繁琐且价格昂贵；也已有相关粪便dna转化方法，但是存在转化效果不稳定、操作繁琐且价格昂贵等诸多缺点；另外，传统方法对于粪便dna提取与转化是分两个阶段完成，存在dna损耗大、利用率低、操作繁琐且价格昂贵等诸多缺点，很难满足下游的分子诊断需求。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种大量提取转化粪便dna的方法，可为下游的检测提供更多可能性。

本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：

技术方案一：

一种大量提取粪便dna的方法，包括以下步骤：

1.取5～35mlbufferspb至离心管中，所述bufferspb包括10～500mmedta、10～500mmtris、50～500mmnacl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入50～1000μlbuffersls，所述buffersls包括10～500mmedta、10～500mmtris、10～20％sds，颠倒混匀，再加入50～500μl蛋白酶k，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；

3.将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；

4.取2～6ml上清于新的离心管中，加入1～2mlbuffersdl，所述buffersdl包括10～500mmedta、10～500mmtris、0.5～5％pvp10和0.5～3.5m醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5ml有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；

6.往离心管加入100～800μlbufferdte，所述bufferdte包括10～20mmtris，5～10mm的edta，涡旋混匀至沉淀散开；

7.10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管；

8.加入200～800μlbufferdbb和300～700μl无水乙醇，所述bufferdbb包括10～500mmedta、10～500mmtris及4～6m胍盐，胍盐包括异硫氰酸胍或盐酸胍中的至少一种，充分振荡混匀；

9.将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

10.将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

11.加入500～750μlbufferdw1于纯化柱中，所述bufferdw1包括150～400mmtris，40～100mm的edta，2～5m异硫氰酸胍以及40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

12.加入500～750μlbufferdw2于纯化柱中，所述bufferdw2包括300～700mmtris，0.8～1.2m的nacl以及70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

13.换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；

14.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

15.滴加30～200μlbufferdte于纯化柱膜上，所述bufferdte包括10～20mmtris，5～10mmedta，50～70℃孵育1～5min；

16.10000～14000g离心1～5min，得到粪便dna。

技术方案二：

一种大量转化粪便dna的方法，包括以下步骤：

1.往离心管中加入10～200μl内含1ng～5μg待转化的粪便dna；

2.再加100～800μlbufferbcb，所述bufferbcb包括10～500mmedta、10～500mmtris及0.5～5m亚硫酸盐，溶液ph4.0～7.0；

3.再往离心管加入10～300μlbufferdpb，所述bufferdpb包括10～500mmedta、10～500mmtris、20～1000mm对苯二酚，混匀后瞬离；

4.将离心管放在扩增仪器上转化；

5.完成转化后，加入200～800μlbufferdbb和300～700μl无水乙醇，所述bufferdbb包括10～500mmedta、10～500mmtris及3～5.5m异硫氰酸胍，充分振荡混匀；

6.将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

7.将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体；

8.加入500～750μlbufferbdd于纯化柱中，所述bufferbdd包括20～400mmtris，20～500mmedta，20～500mmnaoh，60～100％乙醇，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

9.加入500～750μlbufferdw1于纯化柱中，所述bufferdw1包括150～400mmtris，40～100mmedta，2～5m异硫氰酸胍，40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

10.加入500～750μlbufferdw2于纯化柱中，所述bufferdw2包括300～700mmtris，0.8～1.2mnacl，70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

11.换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；

12.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

13.滴加30～200μlbufferdte于纯化柱膜上，所述bufferdte包括10～20mmtris，5～10mmedta，50～70℃孵育1～5min；

14.10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便dna。

技术方案三：

一种大量提取转化粪便dna的方法，包括以下步骤：

1.取5～35mlbufferspb至离心管中，所述bufferspb包括10～500mmedta、10～500mmtris、50～500mmnacl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入50～1000μlbuffersls，所述buffersls包括10～500mmedta、10～500mmtris、10～20％sds，颠倒混匀，再加入50～500μl蛋白酶k，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；

3.将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；

4.取2～6ml上清于新的离心管中，加入1～2mlbuffersdl，所述buffersdl包括10～500mmedta、10～500mmtris、0.5～5％pvp10和0.5～3.5m醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5ml有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；

6.往离心管加入100～800μlbufferdte，所述bufferdte包括10～20mmtris，5～10mm的edta，涡旋混匀至沉淀散开；

7.7)10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加100～800μlbufferbcb，所述bufferbcb包括10～500mmedta、10～500mmtris及0.5～5m亚硫酸盐；

8.再往离心管加入10～300μlbufferdpb，所述bufferdpb包括10～500mmedta、10～500mmtris、20～1000mm对苯二酚，混匀后瞬离；

9.将离心管放在扩增仪器上转化；

10.完成转化后，加入200～800μlbufferdbb和300～700μl无水乙醇，充分振荡混匀；所述bufferdbb包括10～500mmedta、10～500mmtris及3～5.5m异硫氰酸胍；

11.将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

12.将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

13.加入500～750μlbufferbdd于纯化柱中，所述bufferbdd包括20～400mmtris，20～500mmedta，20～500mmnaoh，60～100％乙醇，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；

14.加入500～750μlbufferdw1于纯化柱中，所述bufferdw1包括150～400mmtris，40～100mmedta，2～5m异硫氰酸胍，40～70％乙醇，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，

15.加入500～750μlbufferdw2于纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，所述bufferdw2包括300～700mmtris，0.8～1.2mnacl，70～90％乙醇；

16.换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；

17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

18.滴加30～200μlbufferdte于纯化柱膜上，所述bufferdte包括10～20mmtris，5～10mmedta，50～70℃孵育1～5min；

19.10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便dna。

技术方案四，用于大量提取和转化粪便dna的组合物，按体积比包括：

1)5-35mlbufferspb；

2)50～1000μlbuffersls；

3)1-2mlbuffersdl；

4)100-800μlbufferdte；

5)100-800μlbufferbcb；

6)10-300μlbufferdpb；

7)20-800μlbufferdbb；

8)500～750μlbufferbdd；

9)500～750μlbufferdw1；

10)500～750μlbufferdw2；

11)30～200μlbufferdte。

本发明方法相比于传统方法具有以下优势：

1.bufferspb可以有效的保护人类粪便细胞或dna不被降解，能满足冷链运输，也能满足室温运输；

2.通过使用本发明方法来提取转化人类粪便dna能明显去除粪便中的pcr抑制剂；

3.传统方法普遍提取少量人类粪便且只用部分核酸去做转化，操作繁琐、价格昂贵且获得转化后人类粪便dna量少。本发明方法可以提取1～5g人类粪便且在提取过程全部应用于转化；

4.传统方法一般转化1ng～2μg人类粪便dna，存在转化效果不稳定、操作繁琐、价格昂贵且转化后人类粪便dna量少，很难满足下游的分子诊断需求。本发明方法可以转化1ng～5μg人类粪便dna，具有成本低、利用率高、重复性好、简单快速且能得到大量转化后的人类粪便dna，为下游的检测提供了更多可能性；

5.传统对于人类粪便dna提取与转化方法是分两个阶段完成，本发明方法将提取和转化合并为一，实现了成本低、利用率高、重复性好、简单快速且能得到大量转化后的人类粪便dna，为下游的检测提供了更多可能性；

6.本发明方法样本不局限于人类粪便，也可应用于其他动物粪便样本类型。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1～2为人类粪便dna提取浓度比较图，黑色填充柱表示的是本发明的提取方法，白色填充柱表示qiagen提取方法。

图3～4为人类粪便dna转化后荧光pcrct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的转化方法，白色填充柱表示qiagen转化方法。

图5～6为人类粪便dna提取转化后荧光pcrct值图，黑色填充柱表示的是本发明的提取转化方法。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明。现以人类粪便为例：

实施例1

对照试剂盒采用qiaampfastdnastoolminikit，共提取8例粪便样本，提取步骤如下：

1.取10mlinhibitexbuffer于离心管中，再取1g粪便样本，涡旋1min至样本充分均质；

2.取2ml悬浊液至离心管中，全速离心1min；

3.取600μl上清至2ml离心管中，分别加入25μl蛋白酶k、加入600μlbufferal，震荡混匀并涡旋15s；

4.70℃加热裂解10min；

5.取出再加入600μl无水乙醇，震荡混匀；

6.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

7.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

8.使用500μlbufferaw1，12000g离心1min，倒去收集管中液体；

9.使用500μlbufferaw2，12000g离心3min，换用新的收集管；

10.空甩12000g离心3min，换新的离心管；

11.使用50μlate洗脱产物，静置1min后12000g离心1min，得到人类粪便dna。

根据本发明，共提取8例与对照一样的粪便样本，提取步骤如下：

1.取6mlbufferspb(50mmedta、50mmtris、100mmnacl、30％无水乙醇)至离心管中，再取1g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入500μlbuffersls(50mmedta、50mmtris、20％sds)，颠倒混匀，再加入100μl蛋白酶k，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴10min；

3.将离心管转至室温水浴3min，10000g离心1min；

4.取5ml上清于新的离心管中，加入1mlbuffersdl(50mmedta、50mmtris、2％pvp10和1m醋酸钠)上下颠倒混匀，10000g离心2min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加3ml异丙醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；

6.往离心管加入300μlbufferdte(20mmtris，10mmedta)，涡旋混匀至沉淀散开；

7.12000g离心2min，吸取全部液体至离心管；

8.加入300μlbufferdbb(50mmedta、50mmtris及4.5m异硫氰酸胍)和300μl无水乙醇，充分振荡混匀；

9.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

10.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

11.加入700μlbufferdw1(50mmtris，50mmedta，2m异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

12.加入700μlbufferdw2(50mmtris，0.8mnacl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

13.换用新的收集管，12000g离心2min；

14.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

15.滴加50μlbufferdte(20mmtris，10mmedta)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；

16.12000g离心2min，得到转化后的人类粪便dna。

实施例2

对照试剂盒采用epitectfastbisμlfiteconversionkits，共转化5例粪便核酸样本，转化步骤如下：

1.在pcr管中加入20μldna样本中加入85μlbisulfitesolution和35μldnaprotectbuffer；

2.混匀后将离心管放在扩增仪器上，按说明书程序转化；

3.转化后将上述140μl液体转入干净的1.5ml离心管中；

4.加入310μlbufferbl和250μl无水乙醇，混匀后瞬时离心；

5.将混合液加入到离心柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；

6.加入500μlbufferbw于纯化柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；

7.加入500μlbufferbd于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；

8.加入500μlbufferbw于纯化柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；

9.重复步骤“8”一次；

10.加入250μl无水乙醇于纯化柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；

11.换用新的收集管，12000g离心2min；

12.将纯化柱放置于60℃金属浴上5min；

13.丢弃收集管，将纯化柱放置于新离心管中；

14.滴加50μlbuffereb于纯化柱膜上，室温孵育5min；

15.12000g离心1min，得到转化后的人类粪便dna。

根据本发明，共转化8例与对照一样的粪便核酸样本，转化步骤如下：

1.往离心管中加入20μl待转化的人类粪便dna；

1.往离心管加100μlbufferbcb(50mmedta、50mmtris及4m亚硫酸氢钠)；

2.再往离心管加入20μlbufferdpb(50mmedta、50mmtris、100mm对苯二酚)，混匀后瞬离；

3.将离心管放在扩增仪器上转化；

4.完成转化后，加入300μlbufferdbb(50mmedta、50mmtris及4.5m异硫氰酸胍)和250μl无水乙醇，充分振荡混匀；

5.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

6.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

7.加入700μlbufferbdd(50mmtris，50mmedta，50mmnaoh，90％乙醇)于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

8.加入700μlbufferdw1(50mmtris，50mmedta，2m异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

9.加入700μlbufferdw2(50mmtris，0.8mnacl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

10.换用新的收集管，12000g离心2min；

11.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

12.滴加50μlbufferdte(20mmtris，10mmedta)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；

13.12000g离心2min，得到转化后的人类粪便dna。

实施例3

根据本发明，共提取转化6例粪便样本，提取转化步骤如下：

1.取6mlbufferspb(50mmedta、50mmtris、100mmnacl、30％无水乙醇)至离心管中，再取1g粪便样本至管中，充分振荡混匀；

2.先加入500μlbuffersls(50mmedta、50mmtris、20％sds)，颠倒混匀，再加入50μl蛋白酶k，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴10min；

3.将离心管转至室温水浴3min，10000g离心1min；

4.取5ml上清于新的离心管中，加入1mlbuffersdl(50mmedta、50mmtris、2％pvp10和1m醋酸钠)上下颠倒混匀，10000g离心2min；

5.取全部上清于新的离心管中，再加3ml异丙醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；

6.往离心管加入250μlbufferdte(20mmtris，10mmedta)，涡旋混匀至沉淀散开；

7.12000g离心2min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加500μlbufferbcb；

8.再往离心管加入50μlbufferdpb(50mmedta、50mmtris、100mm对苯二酚)，混匀后瞬离；

9.将离心管放在扩增仪器上转化；

10.完成转化后，加入600μlbufferdbb(50mmedta、50mmtris及4.5m异硫氰酸胍)和600μl无水乙醇，充分振荡混匀；

11.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

12.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

13.加入700μlbufferbdd(50mmtris，50mmedta，50mmnaoh，90％乙醇)于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

14.加入700μlbufferdw1(50mmtris，50mmedta，2m异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

15.加入700μlbufferdw2(50mmtris，0.8mnacl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；

16.换用新的收集管，12000g离心2min；

17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；

18.滴加50μlbufferdte(20mmtris，10mmedta)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；

19.12000g离心2min，得到转化后的人类粪便dna。

利用thermoscientific公司生产的nanodrop2000测定以上3个实施例所获dna的浓度。利用标准差分析3个实施例所获dna浓度和荧光pcrct值，并作图。

用未转化荧光pcr体系检测提取效果，用转化后荧光pcr体系检测转化效果。采用以下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃变性20s，72℃延伸20s，15个循环；95℃变性10s，60℃变性20s，收集荧光信号，72℃延伸20s，35个循环。

图1～2为人类粪便dna提取浓度和未转化荧光pcrct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的提取方法，白色填充柱表示qiagen提取方法；图3～4为人类粪便dna转化后dna浓度和荧光pcrct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的转化方法，白色填充柱表示qiagen转化方法；图5～6为人类粪便dna提取转化后dna浓度和荧光pcrct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的提取转化方法。