一种具有热恢复特性的新型壳聚糖酶CsnM及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有热恢复特性的内切型壳聚糖酶csnm及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

壳寡糖是壳聚糖经水解后聚合度小于20，分子量小于3900的寡糖，是由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和d-氨基葡萄糖(glcn)通过β-l,4-糖苷键连接而成。由于更低的分子量、更好的溶解性使得壳寡糖相较壳聚糖有着更为广泛的应用。此外，壳寡糖还具备抗肿瘤、降血压、增强免疫力等独特的药理功能活性，这使得壳寡糖在医药、保健品、食品、养殖等领域有了更大的应用价值。

壳聚糖能被多类酶水解。包括非专一性酶类：脂肪酶、蛋白酶、碳水化合物分解酶等，能将壳聚糖水解成聚合度低的壳寡糖。但是非专一性酶类水解到一定程度时，加大酶量也难以提高水解程度，而且水解产物较复杂、难以分离。而使用壳聚糖酶(ec：3.2.1.132)水解壳聚糖来制备寡糖的方法具有反应条件温和、反应过程容易控制等优点，且产物纯度较高，利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌是工业化制备壳寡糖的有效途径。目前，报道的壳聚糖酶活力较低，且热稳定性和储存稳定行较差，严重限制了其工业化应用前景。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型壳聚糖酶csnm及其制备方法。本发明所述壳聚糖酶csnm的最适反应温度为40℃，最适反应ph为5.9；其具有热恢复的特性，酶液煮沸10min后，放置在冰水中(0℃)孵育30min，可恢复其89.1％的活性，利于解决运输过程中酶的稳定性问题。该酶降解方式为内切，酶解主产物为壳二糖和壳三糖。

一方面，本发明提供一种新型壳聚糖酶csnm，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

seqidno.1：

mklsciasfkwhakvlsllelgapvpnlrtrtvavavgglliasgaiagtaaqanavsslapaitavsaastgdlsapakkeiamqlvcsaenssldwkaqygyiedidddrgytggiigftsgtgdmlelvqnyantkpdnnvlkpflpvlrkvngtksheglgqkyvdawhqaakdsvflkeqdklrdsmyfnpavsqgkdsnmsnlgqfmyydaifmhgpgdssdsfggirksamknaytaaaqggdektylqafatarkkimkqenahsdtsrvddaqlkflnegnydlhtlgkwkvygdpyeik

另一方面，本发明还提供一种新型壳聚糖酶csnm对应的核酸序列，如seqidno.2所示。

seqidno.2：

atgaagttgtcttgtatcgcttctttcaagtggcacgctaaggttttgtctttgttggaattgggtgctccagttccaaacttgagaactagaactgttgctgttgctgttggtggtttgttgatcgcttctggtgctatcgctggtactgctgctcaagctaacgctgtttcttctttggctccagctatcactgctgtttctgctgcttctactggtgacttgtctgctccagctaagaaggaaatcgctatgcaattggtttgttctgctgaaaactcttctttggactggaaggctcaatacggttacatcgaagacatcgacgacgacagaggttacactggtggtatcatcggtttcacttctggtactggtgacatgttggaattggttcaaaactacgctaacactaagccagacaacaacgttttgaagccattcttgccagttttgagaaaggttaacggtactaagtctcacgaaggtttgggtcaaaagtacgttgacgcttggcaccaagctgctaaggactctgttttcttgaaggaacaagacaagttgagagactctatgtacttcaacccagctgtttctcaaggtaaggactctaacatgtctaacttgggtcaattcatgtactacgacgctatcttcatgcacggtccaggtgactcttctgactctttcggtggtatcagaaagtctgctatgaagaacgcttacactgctgctgctcaaggtggtgacgaaaagacttacttgcaagctttcgctactgctagaaagaagatcatgaagcaagaaaacgctcactctgacacttctagagttgacgacgctcaattgaagttcttgaacgaaggtaactacgacttgcacactttgggtaagtggaaggtttacggtgacccatacgaaatcaag

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶csnm的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述壳聚糖酶csnm在降解壳聚糖中的应用。

另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为csnm。

优选：所述降解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为40℃。

优选：所述降解条件中反应ph为4.9～7.1。最适反应ph为5.9。

有益效果：

1.本发明的壳聚糖酶csnm为结构与功能新颖的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列与已有性质报道的壳聚糖酶序列相似度仅为63％。

2.本发明提供了一种制备壳聚糖酶csnm的方法，即利用基因工程的技术方法，将csnm的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达680.2u/ml，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达90.6％，蛋白质纯度高达95％。

3.本发明的壳聚糖酶csnm具有优良的理化性质，该酶最适反应ph为5.9，其具有热恢复的特性，酶液煮沸10min后，在冰水中(0℃)放置30min，可恢复其89.1％的活性。利用该重组酶进行了降解产物分析，该酶降解主产物为壳寡糖二糖和三糖。本发明所述的壳聚糖酶csnm具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明壳聚糖酶csnm蛋白质分离纯化图(m，蛋白质标准品；1，纯化所得壳聚糖酶csnm)；

图2为本发明壳聚糖酶csnm的温度和ph适应性分析(a，壳聚糖酶csnm的最适反应温度；b，壳聚糖酶csnm的温度稳定性；c，壳聚糖酶csnm的最适反应ph；d，壳聚糖酶csnm的ph稳定性)；

图3为本发明壳聚糖酶csnm的热恢复性分析(a，不同温度下孵育1h后冰上孵育0和30min后csnm的热恢复性比较；b，煮沸不同时间对酶热恢复性的影响；c，不同孵育温度对壳聚糖酶csnm的热恢复性影响；d，不同孵育时间对壳聚糖酶csnm的热恢复性影响)

图4为薄层层析(tlc)法检测本发明壳聚糖酶csnm的酶解产物(m，壳寡糖dp＝1-4标准品；0-6依次为该酶降解壳聚糖0min、1min、10min、30min、120min、360min、1440min)；

图5为本发明壳聚糖酶最终酶解产物的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1壳聚糖酶csnm的序列分析及重组表达

本发明所述壳聚糖酶csnm的产酶基因csnm来源于海洋细菌pseudoalteromonasesp.sy39，包含有927个碱基序列，编码309个氨基酸序列。利用nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)中的保守结构域分析conserveddomain(cdd)和多重序列比对basiclocalalignmentsearchtool(blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶gh家族的壳聚糖酶保守区。已经报道的壳聚糖酶中，与csnm氨基酸序列相似度最高的为多糖水解酶第46家族(gh46)的壳聚糖酶(genbankemf00356)，两者之间的氨基酸序列相似度(identity)为63％。该发明所述的壳聚糖酶csnm归属于多糖水解酶(gh46)家族。

将csnm的产酶序列以限制性内切酶ncoi和xhoi为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：seqidno.3：pcsnm-f：

5’-catgccatggaagttgtcttgtatcgct-3’(ncoi)

反向引物：seqidno.4：pcsnm-r：

5’-ccgctcgagcttgatttcgtatgggtca-3’(xhoi)

pcr扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。pcr反应所用dna聚合酶为primerstarhs购自大连宝生物公司。

pcr产物用限制性内切酶ncoi和xhoi进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的pcr产物。pet22b(+)质粒dna(美国invitrogen公司)，同样用限制性内切酶ncoi和xhoi进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、dna用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的pcr产物和pet-22b(+)质粒载体参照dna连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌dh5α菌株(美国invitrogen公司)，涂布在luria-bertani(lb)培养基固体平板上(含有50μg/ml氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至lb液体培养基中(含有50μg/ml氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pet22b-csnm。重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为bl21(de3)/pet22b-csnm，保存在-80℃备用。

实施例2壳聚糖酶csnm的制备及纯化方法

将重组菌株bl21(de3)/pet22b-csnm在100ml的lb液体培养基中(50μg/ml氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至od600＝0.6，加入终浓度为0.1mm的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，在20℃诱导20h。壳聚糖酶活性测定方法为：100μl酶液加入900μl0.3％壳聚糖底物(20mm醋酸-醋酸钠，ph＝5.9)，在40℃下反应10min，加入750μl的dns试剂，沸水中反应10min进行显色，在od520下检测其吸光度。酶活力定义为1u为每min产生1μm还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达680.2u/ml。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10ml镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mm咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mm的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到90.6％。纯化所得壳聚糖酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，如图1所示，纯化所得壳聚糖酶csnm的分子量为30kda，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得壳聚糖酶csnm的蛋白纯度达到95％以上。

实施例3温度和ph对壳聚糖酶csnm的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶csnm在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和ph对酶活力的影响。在不同温度(0-70℃)下反应10min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下csnm的相对酶活力。如图2a所示，壳聚糖酶csnm的最适反应温度为40℃。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶csnm在不同温度(0-70℃)下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度(40℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图2b所示，壳聚糖酶csnm温度稳定性较差，在40℃下孵育1h，酶活性仅剩15.8％。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶csnm与用不同的缓冲液体系配成不同ph的壳聚糖底物反应，使用的缓冲液分别为乙酸钠缓冲液(50mm，ph4.49-5.9)，磷酸盐缓冲液(50mm，ph5.88-7.12)和tris-hcl缓冲液(50mm，ph6.22-7.11)。在最适温度下检测活性，酶活性最高值为100％。如图2c所示，壳聚糖酶csnm的最适反应ph为5.9。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶csnm在不同ph条件(4.7-10.8)下孵育24h，取出后，立即在其最适反应ph(5.9)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图2d所示。

实施例4壳聚糖酶csnm的热恢复性测定

将实施例2中纯化所得csnm在不同温度(0-70℃)下孵育1h，分别在冰上孵育0min和30min，在其40℃下检测其酶活力。如图3a所示，在冰上孵育30min所测得活性，显著高于不孵育直接检测的活性。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶csnm煮沸不同时间(5-40min)，然后将其在冰上孵育0min和30min后在40℃下检测其酶活力。如图3b所示，煮沸5-40min后，在冰上孵育30min，可部分恢复其酶活力，其中煮沸时间越短，恢复能力越强。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶煮沸10min，然后取出立即放置在0-50℃下孵育30min，检测其剩余酶活力，以不煮沸酶液的活力为100％；以煮沸后直接检测所得酶活力作为阴性对照；检测不同孵育温度对其热恢复性的影响；如图3c所示，壳聚糖酶csnm经煮沸10min后，放置在10℃孵育30min，效果最佳，可恢复其92.3％的活性。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶煮沸10min，取出后立即放置在0℃孵育不同时间(0-45min)，检测不同孵育时间对酶恢复性的影响。如图3d所示，随着孵育时间延长，酶的热恢复性逐渐增强，在45min时热恢复性达到最高值，再延长孵育时间热恢复性不再增加。

实施例5壳聚糖酶csnm酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶csnm纯酶与0.3％壳聚糖在30℃下分别孵育0min、1min、10min、30min、120min、360min、1440min，然后在高效薄层层析板(hptlc)检测。具体为：将hptlc层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰醋酸:水＝2:2:1)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(0.5％茚三酮乙醇溶液)中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，壳聚糖酶csnm酶解主产物为壳二糖(dp2)和壳三糖(dp3)。

如图4所示，酶解反应初期(0-10min)，大量大片段的寡糖产生，随着酶解反应的进行，大片段的寡糖逐渐转化为小片段的寡糖，说明该酶的作用方式是以内切的方式，从壳聚糖分子内部进行切割。

实施例6壳聚糖酶csnm酶解产物高效液相法测定

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶与0.3％的壳聚糖底物孵育24小时，降解产物12,000g离心10min，弃沉淀，将100μl上清和体积(5μl)的0.1m的amac溶液(溶于二甲基亚砜和冰醋酸的17：3(v/v)混合物)和1m硼氰化钠(100μl)。将混合物在黑暗中于90℃温育40min，并在-20℃下停止反应。加入500μl的50％二甲基亚砜并离心并上样于预平衡(0.2m的碳酸氢铵)的凝胶过滤柱(superdexpeptide10/300)。流速为0.6ml/min，流动相为0.2m的碳酸氢铵，检测时间为40min，检测器为视差检测器，如图5所示。

序列表

<110>青岛大学

<120>一种具有热恢复特性的新型壳聚糖酶csnm及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>309

<212>prt

<213>未知(unknown)

<400>1

metlysleusercysilealaserphelystrphisalalysvalleu

151015

serleuleugluleuglyalaprovalproasnleuargthrargthr

202530

valalavalalavalglyglyleuleuilealaserglyalaileala

354045

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65707580

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130135140

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145150155160

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aspserseraspserpheglyglyilearglysseralametlysasn

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260265270

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gacaacaacgttttgaagccattcttgccagttttgagaaaggttaacggtactaagtct480

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ttcttgaaggaacaagacaagttgagagactctatgtacttcaacccagctgtttctcaa600

ggtaaggactctaacatgtctaacttgggtcaattcatgtactacgacgctatcttcatg660

cacggtccaggtgactcttctgactctttcggtggtatcagaaagtctgctatgaagaac720

gcttacactgctgctgctcaaggtggtgacgaaaagacttacttgcaagctttcgctact780

gctagaaagaagatcatgaagcaagaaaacgctcactctgacacttctagagttgacgac840

gctcaattgaagttcttgaacgaaggtaactacgacttgcacactttgggtaagtggaag900

gtttacggtgacccatacgaaatcaag927

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catgccatggaagttgtcttgtatcgct28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccgctcgagcttgatttcgtatgggtca28