本发明属于植物酶提取技术领域，具体涉及一种木瓜蛋白酶粗酶的分离方法。
背景技术：
木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜(carieapapaya)的茎叶和果实中，未成熟的乳汁中含量最高。因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强，对多种蛋白质均具有很好的降解作用，目前已被广泛应用于各个行业。在食品中，木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中。由于其为纯天然产物，因此开发前景广阔。
现有文献表明提取和利用木瓜蛋白酶已成为当今科技研究的热点之一。以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原科生产木瓜蛋白酶，由于番木瓜种植区主要分布于经济不发达地区，因此蛋白酶生产工艺相对落后。在木瓜蛋白酶的制备过程中，要提高木瓜蛋白酶的质和量，必须要加入酶活性保护剂，减少酶失活，干燥过程中温度不宜过高，同时去除杂质。常用的酶保护剂有亚硫酸氢钠、edta、焦亚硫酸钠等。目前，木瓜蛋白酶的提取主要采用化学方法，化学方法一方面工艺条件要求很多，操作过程比较繁琐，耗时耗能均较多；另一方面，需要使用大量的化学试剂，成本很高。木瓜蛋白酶传统提取方法存在严重缺陷：木瓜青果乳汁割收方法落后，卫生条件差，乳汁损失大，褐变严重，酶活性低。目前，市场对木瓜蛋白酶需求量增长迅速，而目前的生产方式又不能满足市场的需求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种通过湿法珠磨法有效提高木瓜乳汁割收量，并通过dtnb硝基苯甲酸二硫化合物作为保护剂，有效提高木瓜蛋白酶酶活性的木瓜蛋白酶粗酶的分离方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种木瓜蛋白酶粗酶的分离方法，包括如下步骤，
(1)木瓜预处理：将木瓜鲜果洗净、切成碎块，浸泡在水中；
(2)湿法珠磨破碎：待木瓜充分吸收水分后将其倒入珠磨机中，并按体积比加入10-20％用量研磨剂，进行珠磨破碎，研磨时间10-30min，研磨剂与细胞之间进行相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；破碎后通过珠液分离器，将研磨剂与乳汁分离，并将果肉纤维滤去，得到滤液；
(3)低温真空干燥：在滤液中加入保护剂，将滤液置于低温真空干燥机中干燥，干燥10-30min即得粗酶；
(4)饱和盐析：通过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，即得木瓜蛋白酶产品。
作为技术方案的优选，所述步骤(2)中的研磨剂为玻璃小珠、石英砂、氧化铝中的一种或其互相组合的磨球。
作为技术方案的优选，所述磨球之间的质量比为玻璃小珠或石英砂∶氧化铝＝1:2，或玻璃小珠∶石英砂∶氧化铝＝1:2:1。
作为技术方案的优选，所述研磨剂的直径小于1mm。通过研磨剂与木瓜的之间研磨破碎，尽可能的将木瓜研磨成乳汁，提高木瓜乳汁的出汁量。研磨剂的直径在1mm以下时，能够使得研磨的更加均匀的细密，使得其内的木瓜蛋白酶能够尽可能的溶解到乳汁内。
作为技术方案的优选，所述步骤(3)中保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物，添加量为0.05-1％。dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与木瓜蛋白酶的巯基具有较高的结合度，在干燥时能够有效的对其进行保护，提高酶的活性。
作为技术方案的优选，所述步骤(3)中保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与edta、亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠中的两种或三种组合，而成的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.05-0.5％。在进行组合时可以降低保护剂的用量，实现更加高效保护。
作为技术方案的优选，两种保护剂组合则用量配比为1：0.5-2；三种保护剂组合用量配比为1：0.5-1.2：0.2-0.8。
作为技术方案的优选，所述步骤(3)进行低温真空干燥时控制干燥机内真空度-0.09～0.03kpa，温度35～50℃。真空干燥时的温度不能过高，否则会影响木瓜蛋白酶的活性。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用湿法珠磨破碎的方法代替传统撕裂、积压、揉搓、混切或者胶体磨步骤，破碎效果更好，实现木瓜果肉纤维的破碎和分离，通过湿法珠磨破碎木瓜乳汁细腻均匀，有效的提高乳汁的割收量，是其中的木瓜蛋白酶能够充分释放出来。
2、本发明采用dtnb硝基苯甲酸二硫化合物或其组合作为保护剂，在进行低温真空干燥时可以更有效的保护木瓜蛋白酶中的活性巯基，提高酶的活性。
3、本发明的工艺流程更加优化，能够得到更多的木瓜乳汁，在制备过程中能够有效防止褐变，有效的保护木瓜蛋白酶的巯基，防止酶活性降低，最后制得的木瓜蛋白酶的酶活性可达到60万u/g以上。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例来对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
一种木瓜蛋白酶粗酶的分离方法，包括如下步骤，
(1)木瓜预处理：将木瓜鲜果洗净、切成碎块，浸泡在水中；
(2)湿法珠磨破碎：待木瓜充分吸收水分后将其倒入珠磨机中，并按体积比加入20％用量研磨剂，研磨剂为石英砂，研磨剂的直径小于1mm，进行珠磨破碎，研磨时间30min，研磨剂与细胞之间进行相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；破碎后通过珠液分离器，将研磨剂与乳汁分离，并将果肉纤维虑去，得到滤液；
(3)低温真空干燥：在滤液中加入保护剂，保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物，添加量为1％，将滤液置于低温真空干燥机中干燥，进行低温真空干燥时控制干燥机内真空度0.03kpa，温度50℃，干燥10min即得粗酶；
(4)饱和盐析：通过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，即得木瓜蛋白酶产品。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥60万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥90％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例2
一种木瓜蛋白酶粗酶的分离方法，包括如下步骤，
(1)木瓜预处理：将木瓜鲜果洗净、切成碎块，浸泡在水中；
(2)湿法珠磨破碎：待木瓜充分吸收水分后将其倒入珠磨机中，并按体积比加入15％用量研磨剂，研磨剂为玻璃小珠、石英砂、氧化铝互相组合的磨球，磨球之间的质量比为1:2:1，研磨剂的直径小于1mm，进行珠磨破碎，研磨时间10min，研磨剂与细胞之间进行相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；破碎后通过珠液分离器，将研磨剂与乳汁分离，并将果肉纤维虑去，得到滤液；
(3)低温真空干燥：在滤液中加入保护剂，保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物，添加量为0.05％，将滤液置于低温真空干燥机中干燥，进行低温真空干燥时控制干燥机内真空度-0.09kpa，温度35℃，干燥30min即得粗酶；
(4)饱和盐析：通过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，即得木瓜蛋白酶产品。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥70万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥93％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例3
一种木瓜蛋白酶粗酶的分离方法，包括如下步骤，
(1)木瓜预处理：将木瓜鲜果洗净、切成碎块，浸泡在水中；
(2)湿法珠磨破碎：待木瓜充分吸收水分后将其倒入珠磨机中，并按体积比加入10％用量研磨剂，研磨剂为石英砂、氧化铝互相组合的磨球，磨球之间的质量比为1:2，研磨剂的直径小于1mm，进行珠磨破碎，研磨时间20min，研磨剂与细胞之间进行相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；破碎后通过珠液分离器，将研磨剂与乳汁分离，并将果肉纤维滤去，得到滤液；
(3)低温真空干燥：在滤液中加入保护剂，保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与edta的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.5％，两种保护剂组合则用量配比为1：2；将滤液置于低温真空干燥机中干燥，进行低温真空干燥时控制干燥机内真空度0.01kpa，温度40℃，干燥25min即得粗酶；
(4)饱和盐析：通过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，即得木瓜蛋白酶产品。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥80万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥95％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例4
一种木瓜蛋白酶粗酶的分离方法，包括如下步骤，
(1)木瓜预处理：将木瓜鲜果洗净、切成碎块，浸泡在水中；
(2)湿法珠磨破碎：待木瓜充分吸收水分后将其倒入珠磨机中，并按体积比加入18％用量研磨剂，研磨剂为玻璃小珠、氧化铝，比例为1:2，研磨剂的直径小于1mm，进行珠磨破碎，研磨时间25min，研磨剂与细胞之间进行相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；破碎后通过珠液分离器，将研磨剂与乳汁分离，并将果肉纤维滤去，得到滤液；
(3)低温真空干燥：在滤液中加入保护剂，保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与edta、亚硫酸氢钠的三种组合，而成的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.05％，三种保护剂组合用量配比为1：1.2：0.8，将滤液置于低温真空干燥机中干燥，进行低温真空干燥时控制干燥机内真空度-0.05kpa，温度45℃，干燥15min即得粗酶；
(4)饱和盐析：通过饱和硫酸铵盐析对其进一步分离纯化，去除其他蛋白质和小分子物质，即得木瓜蛋白酶产品。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥65万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥90％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例5
本实施例与实施例3不同的地方在于：步骤(3)中保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与亚硫酸氢钠的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.2％，两种保护剂组合则用量配比为1：0.5。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥75万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥90％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例6
本实施例与实施例3不同的地方在于：步骤(3)中保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与焦亚硫酸钠的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.4％，两种保护剂组合则用量配比为1：1。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥80万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥90％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例7
本实施例与实施例4不同的地方在于：步骤(3)中保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与edta、亚硫酸氢钠三种组合，而成的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.05-0.5％，三种保护剂组合用量配比为1：0.5：0.2。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥70万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥90％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。
实施例8
本实施例与实施例4不同的地方在于：步骤(3)中保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与edta、焦亚硫酸钠三种组合，而成的组合保护剂，组合保护剂的添加量为0.05-0.5％，三种保护剂组合用量配比为1：1：0.5。
本发明制备的木瓜蛋白酶产品：酶活力：≥65万u/g；颜色为乳白色或淡黄色粉末，粉末疏松、且均匀一致；无结块，无肉眼可见杂质。溶解度：≥90％；水分：≤5％；菌落总数：＜1000；沙门氏菌：无；大肠杆菌：无；符合国家相关标准。