一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法与流程

本发明涉及一种以磷脂酶d转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

磷酯酰丝氨酸(简称ps)是存在于细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中的一种重要膜磷脂，也是大脑中的主要酸性磷脂。虽然在人体内数量很少，但其保健功效显著，具有改善老年人阿尔茨海默病、提高认知力、抗抑郁、抗压抑等功效。它可以影响信息间传递，被誉为继胆碱和dha之后一大新兴“智能营养素”，可用于医药，食品等领域，作为食品添加剂添加在酸奶，奶粉及营养剂中。

ps于2010年10月21日被原中国卫生部(现更名为国家卫生计生委)添加到新资源食品目录中，允许其作为新资源食品。目前中国市面上可随膳食一起食用的磷脂酰丝氨酸产品不多，常见的有美国的自然之宝记忆原素、gnc健安喜磷脂酰丝氨酸、puritan'spride脑磷脂ps、宝利美添加磷酯酰丝氨酸的藻油dha软胶囊以及脑黄金磷脂酰丝氨酸dha复合片。

制备磷脂酰丝氨酸的方法主要有提取法和酶转化法。目前市面上出售的ps多是利用有机试剂氯仿/甲醇(2:1，v/v)从牛脑或大豆中提取，一方面提取工艺复杂且产量较少，另一方面由于疯牛病原因，其产品安全性也受到一定程度质疑。sigma出售的从牛脑提取的纯度为97％的ps售价约为120元/mg，从土豆中提取的纯度为97％的ps售价约为62.68元/mg，阿拉丁等其他试剂公司售价与其类似。与提取法相比，酶转化法工艺简单，条件温和，产物收率高且低碳环保，这也表明了其市场前景广阔。

然而，现有的酶转化法生产磷脂酰丝氨酸大多在有机相中进行，获得的产物安全性存疑，不适用于食品领域。而目前在水相中用酶转化法生产磷脂酰丝氨酸的副产物含量极高。yugolwasaki等以pc70(质量分数为70％的磷脂酰胆碱)作为底物在纯水相中进行反应，反应24h，时仅获得约5％的ps，10％的副产物pa(甘油磷脂酸)，此时还有约80％pc未被消耗。saovaneechoojit等以pc50作为底物在纯水相中进行反应，反应结束时仅生成约26％的ps；duanzhangqun等以pc98作为底物，在反应24h后也仅生成不到10％的ps，生成约40％的副产物pa，此时还有约50％的底物pc未被消耗。此外，现有的酶转化法生产磷脂酰丝氨酸大多以pc98(质量分数为98％的磷脂酰胆碱)为底物，成本较高，sigma公司目前出售的pc98价格为每100mg545元，成本较高，不适合大规模工业生产。我们目前使用的pc60价格则为每千克200元(报价来源于博帅天津生物科技有限公司)。toshiyukiitoh和magaretsivapragasam等人指出在离子液中也能进行转酯反应，虽然检测到了产物ps的生成，但离子液价格昂贵，工业化生产势必增加过多额外成本。因此，提供一种安全、副产物含量低、成本低廉、产率较高的磷脂酰丝氨酸生产方法，对于工业上制备磷脂酰丝氨酸具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种以磷脂酶d转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，是以质量分数为30％-70％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在水相中反应；磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:9-1:11，ph为5-6，温度为35-50℃，反应时间为6-12h，磷脂酶d添加量为50-70u/g磷脂酰胆碱，反应体系中添加了盐离子，所述盐离子包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾或氯化锌。

在本发明的一种实施方式中，是以质量分数为60％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物。

在本发明的一种实施方式中，磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:10。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中ph为5.5-6。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为40-45℃。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中添加了质量分数为5-10％的盐离子。

在本发明的一种实施方式中，添加质量分数为5-10％的氯化钙、氯化镁或氯化锌。

在本发明的一种实施方式中，反应时间为5-10h。

在本发明的一种实施方式中，反应时间优选5-6h。

本发明的有益效果：

本发明是以磷脂酶d为催化剂，并以pc60和l-丝氨酸为底物，通过优化底物摩尔比、反应ph、温度、反应时间、酶添加量、盐离子种类及浓度等，发现底物摩尔比为磷脂：丝氨酸＝1:9-11，ph为5.5左右，反应温度45℃，磷脂酶d添加量为50u/g磷脂酰胆碱，反应6小时后，磷酯酰丝氨酸(ps)产率为55.1％，底物磷脂酰胆碱(pc)剩余2％，几乎无副产物(pa)生成。且此方法得到的产物安全性较高、副产物含量低、成本低廉。

附图说明

图1：底物摩尔比对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

图2：缓冲液ph对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

图3：反应温度对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

图4：反应时间对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

图5：酶添加量对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

图6：盐离子种类对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

图7：盐离子浓度对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。

具体实施方式

(一)液相检测产物方法

色谱柱为sepaxhp-silica(250mm×4.6mm×5μm)，柱温为40℃，流速为1ml/min，蒸发光散色检测器漂移管温度为60℃，增益值为6，氮气流速为1l/min，流动相a为甲醇/水/醋酸/三乙胺(85:15:0.5:0.05)，b为正己烷/异丙醇/a(20:48:32)，洗脱程序为：0-5min100％b；5-15min22％a，78％b；15-27min90％a，10％b，27-28min100％a；28-32min100％a。

实施例1优化底物摩尔比

向100ml烧杯中加入50ml40mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝6)，再加入磷脂酰胆碱(pc60)10g和l-丝氨酸，其摩尔比依次选择为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11，升温到37℃，待底物完全溶解后加入5ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测ps、pa、pc的含量。

如图1所示，磷酯酰丝氨酸的产率随磷脂酰胆碱与l-丝氨酸摩尔比的增加而增大，且向副产物pa方向转化变少。磷脂酰胆碱与l-丝氨酸的摩尔比为1:10时，磷酯酰丝氨酸的产率达到31.2％。

实施例2优化缓冲液ph

向100ml烧杯中分别加入ph为3、4、4.5、5、5.5、6、7的醋酸-醋酸钠缓冲液50ml，再加入磷脂酰胆碱(pc60)10g和l-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到37℃，待底物完全溶解后加入5ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测ps、pa、pc的含量。

由图2可以看出，ph为5.5时，ps产率最高，达33.1％。

实施例3反应温度优化

向100ml烧杯中加入50ml40mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(pc60)10g和l-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，分别升温到30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，待底物完全溶解后加入5ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测ps、pa、pc的含量。

由图3可以看出，反应温度为45℃时，ps产率最高，达37.4％。

实施例4反应时间优化

向100ml烧杯中加入50ml40mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(pc60)10g和l-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后加入5ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，转速300rpm，分别在反应3h、6h、9h、12h时取样检测ps、pa、pc的含量。

由图4可以看出，反应6h时，ps产率最高，达38％。

实施例5酶添加量优化

向100ml烧杯中加入50ml40mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(pc60)10g和l-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后向体系中分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，对应的酶添加量分别为10u/g磷脂酰胆碱、20u/g磷脂酰胆碱、30u/g磷脂酰胆碱、40u/g磷脂酰胆碱、50u/g磷脂酰胆碱、60u/g磷脂酰胆碱、70u/g磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱转速300rpm，反应6h后取样检测ps、pa、pc的含量。

由图5可以看出，酶添加量为5ml时，ps产率最高，达37.7％。

实施例6盐离子种类优化

向100ml烧杯中加入50ml40mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，分别向其中加入质量分数为5％的氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾、氯化锌。再加入磷脂酰胆碱(pc60)和l-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后向体系中加入5ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，转速300rpm，反应6h后取样检测ps、pa、pc的含量。

由图6可以看出体系中添加氯化钙能明显提高ps得率，达到50.8％。

实施例7盐离子浓度优化

向100ml烧杯中加入50ml40mm醋酸-醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，分别向其中加入质量分数为4％、6％、8％、10％、12％、14％的氯化钙。再加入磷脂酰胆碱(pc60)和l-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后向体系中加入5ml磷脂酶d酶液(酶活为100u/ml)，转速300rpm，反应6h后取样检测ps、pa、pc的含量。

由图7可以看出，随着氯化钙浓度由低到高，ps得率也随之提高。当氯化钙浓度为10％时，ps产率最高，达55.1％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。