一种pH稳定性提高的转氨酶突变体的制作方法

本发明属于蛋白质工程
技术领域：
，具体涉及一种ph稳定性提高的转氨酶突变体。
背景技术：
：转氨酶(aminetransaminase：ata)是一种可逆地催化氨基与酮基互换的转移酶，由转氨酶催化生成的产物具有光学纯度高、立体选择性强等优点。随着手性胺类药物的需求量日趋增大，使得选择性转氨酶的研究有了更大开发价值。近年来，大量的天然转氨酶相继被挖掘出来，但通常存在催化效率低、立体选择性差、稳定性弱等缺点，严重限制了产业化应用。最早，codexis公司在专利us8293507中公开，对来源于节杆菌的氨基转移酶(ata117)进行改造，经过11轮的定点饱和突变以及条件优化，最终获得的转氨酶包含了27个位点突变，且成功用于西他列汀药物的生产，这项研究成果为转氨酶在制备手性胺类医药中间体的推广应用带来了信心。此外，andezejlyskowski等人在文献crystalstructureofan(r)-selectivev-transaminasefromaspergillusterreus，plosone,2014,9(1):e87350中报道了转氨酶的晶体结构，为同源二聚体(见图1)。黄俊等人在文献biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2017,483(1):397-402中报道了关于aspergillusterreusata的热稳定性，但野生型在38℃半衰期仅仅10min，通过改造突变，t1050也只有3.5℃的提高，变化并不大。黄俊等人在专利cn105950581中公开，通过理性引入二硫键提高其稳定性，但结果半衰期的时间仅延长了3.5min。在工业的应用中，转氨酶的催化时间通常控制在24～48h之间，低的稳定性也是限制转氨酶产业化的一大障碍。另外，转氨酶的催化反应过程中需要有氨基供体参与，异丙胺因为分子结构简单、价格便宜，是常用的氨基供体，但异丙胺具有强碱性，在反应过程中会导致酶的不稳定，需要用大量酸性试剂来调整ph。如果转氨酶具有高ph的稳定性，不仅可以减少原料的使用，同时在高ph条件下副反应少，反应过程污染机会降低。但关于提高aspergillusterreusata在高ph的稳定性改造，至今未见报道，如果能够提高转氨酶在ph9.5催化条件下的稳定性，将会进一步加快转氨酶的产业化步伐。技术实现要素：为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种ph稳定性提高的转氨酶突变体。一方面，本发明提供的转氨酶突变体的氨基酸序列是seqidno.1所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列的突变位点为第131位的精氨酸突变为丙氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸。进一步，转氨酶突变体氨基酸序列为seqidno.2、seqidno.3或者seqidno.4所示的氨基酸序列。进一步，转氨酶来源于aspergillusterreus。更进一步，转氨酶突变体相对于野生型在ph9.5的条件下，活性可维持在24h内使得转化率达90％。进一步，基因编码如权利要求1所述的转氨酶突变体。进一步，基因核苷酸序列为seqidno.5、seqidno.6或者seqidno.7。本发明的有益效果在于，通过酶基因改造技术，成功获得ph稳定性显著提高的突变体arg131ala、arg131cys和arg131asp，其中稳定性提高幅度最大的是arg131ala，在ph9.5条件下，转化率高达90％。附图说明：图1转氨酶的晶体结构特征图2位于loop区域的三个高柔性氨基酸的结构图图3单个位点饱和突变的电泳图谱图4野生型和突变体转化后的tlc分析图图5气相色谱分析转化后的反应液具体实施方式：下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。实施例1定点饱和突构建基因突变库对筛选到的三个突变位点进行饱和引物设计，具体序列信息见表1。表1饱和突变的引物序列表1中带下划线的序列为突变位点，利用primerstarmaxdna聚合酶(takara公司)在正反向饱和引物的参与下，以重组质粒pet24a-ata为模板，进行全质粒扩增反应，pcr反应程序参考表2。表2全质粒扩增程序表pcr结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果图见图3。接着利用fddpni限制性内切酶对pcr产物进行重组质粒模板消化，再经过纯化之后，直接转入大肠杆菌bl21(de3)感受态，42℃热击90s，37℃孵育1h。之后将其涂布与含有50ug/l卡那霉素的lb平板上，在37℃的培养箱中倒置培养24h，待长出布满平板的单克隆菌落即饱和突变库构建成功。实施例2阳性克隆的高通量筛选为了保证突变体有95％的覆盖率，对每个突变库要随机挑去193个单克隆进行96孔板振荡培养，其中每个平板上预留三个孔作为野生型对照培养。在无菌的96孔板中事先转入400ul的lb培养基，37℃培养约12h，按照10％的接种量，转接于第二个96孔板中培养，剩余的加入甘油保护，控制甘油的终浓度15％，保存于-40℃冰箱。新转接的96孔板继续培养，待od600达到0.4(即培养37℃培养约3h)，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导表达，诱导的温度降低到16℃，继续培养12-16h。培养结束后在离心机上对96孔板直接离心，转速在4000rpm，离心30min后倒掉上清。将转化体系按照表3中配制，用排枪吸取400ul转入上述离心后的96孔板中，在35℃的恒温下，500rpm的转速下反应24h。最后对所有转化反应液进行tlc点板，高锰酸钾显色观察底物的降解和产物的生成，筛选阳性克隆。表3单克隆细胞的转化体系实施例3转化结果的分析方法tlc点板分析：利用tlc点板显色法观察结果。tlc板均采用硅胶板，在两种不同的扩展剂下可以不同的显色图，利用乙酸乙酯作为扩展剂，则在高锰酸钾的显色下能够清晰的看出底物减少量的变化(见图4a)。利用甲醇/乙酸乙酯/氨水＝6.5/5.5/0.2为展开剂，则可以看到产物的生成结果(见图4b)。从图4a中明显可以观察到突变体r131a的底物减少最多，而野生型wt几乎没有发生变化，图4b中的结果也和图4a相对应，r131a转化后生成的产物最多，其他突变体也都出现产物生成，唯独野生型没有观察到产物生成。gc色谱分析：借助气相色谱仪分析，定量的分析出转化率。首先将标准的底物和产物进行色谱定位，然后将转化反应液蒸发除去液体，再进行气相色谱分析，转化率在为90％，结果见图5。实施例4突变体的测序及菌体保存从筛选的结果中，找到对应于最初96孔板中的单克隆，进行菌体测序，根据序列的比对可以确定氨基酸的变化，表4为测序获得的序列突变信息。表4测序后的密码子和氨基酸突变信息samplecodonmutation1b6cgt->gcgr131a2d8cgt->tgtr131c2h8cgt->gatr131d测序确定突变后，可以将菌体保存于甘油管中，另取一部分进行37℃lb培养基中振荡培养，待od600达到0.6-1.0时，利用质粒提取试剂盒，提取突变后的质粒，并于-40℃冰箱保存，以防长期保存的突变菌，后期质粒脱落将无法获得基因。序列表<110>尚科生物医药（上海）有限公司<120>一种ph稳定性提高的转氨酶突变体<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>325<212>prt<213>aspergillusterreus<400>1metalasermetalaleuvalproalaglythralaalaalaglyala151015ileleuglyserthrglythrthralaproproalaleuglyileala202530thrvalglyglyglyleuvalproleualaglyalaalaileproleu354045leualaglyglypromethisseralaleuthrthralavalproser505560valthralaglyalaproproalaleualaalahisilethralaleu65707580glyalasercysthrleuleualaleualaleuproleuproalaala859095glyvalleuglyileleuvalglymetvalalaleuserglyileala100105110alaalaprovalglyleuilevalthralaglyleuleuglyvalala115120125glythralaproglyalailevalalaalaleuthrmetprovalgly130135140prothrvalthrvalmetglyproalametglyalavalglyglyser145150155160alavalvalalaalathrvalalaalavalproproglyalaileala165170175prothrvalleualaleuglythrglyalaleuvalalaglymetpro180185190glyalaalaalaalaglyalathrthrproproleuthralaglyala195200205alahisleuthrglyglyserglyproalailevalleuvalleuala210215220glyvalleuthrthrproalaalaglyvalleuglyglyvalthrala225230235240leuservalilealaalaalaglyalaproglyileglyvalalaval245250255glyprovalprovalglyleualathralacysalaglyilepromet260265270cysthrthralaglyglyilemetproilethrthrleualaglymet275280285provalalaglyglyglyileglyproilethrleuleuilethrala290295300glythrthralamethisthralaalaalathrserproglyileala305310315320thralaglyalaala325<210>2<211>325<212>prt<213>aspergillusterreus<400>2metalasermetalaleuvalproalaglythralaalaalaglyala151015ileleuglyserthrglythrthralaproproalaleuglyileala202530thrvalglyglyglyleuvalproleualaglyalaalaileproleu354045leualaglyglypromethisseralaleuthrthralavalproser505560valthralaglyalaproproalaleualaalahisilethralaleu65707580glyalasercysthrleuleualaleualaleuproleuproalaala859095glyvalleuglyileleuvalglymetvalalaleuserglyileala100105110alaalaprovalglyleuilevalthralaglyleuleuglyvalala115120125glythralaproglyalailevalalaalaleuthrmetprovalgly130135140prothrvalthrvalmetglyproalametglyalavalglyglyser145150155160alavalvalalaalathrvalalaalavalproproglyalaileala165170175prothrvalleualaleuglythrglyalaleuvalalaglymetpro180185190glyalaalaalaalaglyalathrthrproproleuthralaglyala195200205alahisleuthrglyglyserglyproalailevalleuvalleuala210215220glyvalleuthrthrproalaalaglyvalleuglyglyvalthrala225230235240leuservalilealaalaalaglyalaproglyileglyvalalaval245250255glyprovalprovalglyleualathralacysalaglyilepromet260265270cysthrthralaglyglyilemetproilethrthrleualaglymet275280285provalalaglyglyglyileglyproilethrleuleuilethrala290295300glythrthralamethisthralaalaalathrserproglyileala305310315320thralaglyalaala325<210>3<211>325<212>prt<213>aspergillusterreus<400>3metalasermetalaleuvalproalaglythralaalaalaglyala151015ileleuglyserthrglythrthralaproproalaleuglyileala202530thrvalglyglyglyleuvalproleualaglyalaalaileproleu354045leualaglyglypromethisseralaleuthrthralavalproser505560valthralaglyalaproproalaleualaalahisilethralaleu65707580glyalasercysthrleuleualaleualaleuproleuproalaala859095glyvalleuglyileleuvalglymetvalalaleuserglyileala100105110alaalaprovalglyleuilevalthralaglyleuleuglyvalala115120125glythrcysproglyalailevalalaalaleuthrmetprovalgly130135140prothrvalthrvalmetglyproalametglyalavalglyglyser145150155160alavalvalalaalathrvalalaalavalproproglyalaileala165170175prothrvalleualaleuglythrglyalaleuvalalaglymetpro180185190glyalaalaalaalaglyalathrthrproproleuthralaglyala195200205alahisleuthrglyglyserglyproalailevalleuvalleuala210215220glyvalleuthrthrproalaalaglyvalleuglyglyvalthrala225230235240leuservalilealaalaalaglyalaproglyileglyvalalaval245250255glyprovalprovalglyleualathralacysalaglyilepromet260265270cysthrthralaglyglyilemetproilethrthrleualaglymet275280285provalalaglyglyglyileglyproilethrleuleuilethrala290295300glythrthralamethisthralaalaalathrserproglyileala305310315320thralaglyalaala325<210>4<211>325<212>prt<213>aspergillusterreus<400>4metalasermetalaleuvalproalaglythralaalaalaglyala151015ileleuglyserthrglythrthralaproproalaleuglyileala202530thrvalglyglyglyleuvalproleualaglyalaalaileproleu354045leualaglyglypromethisseralaleuthrthralavalproser505560valthralaglyalaproproalaleualaalahisilethralaleu65707580glyalasercysthrleuleualaleualaleuproleuproalaala859095glyvalleuglyileleuvalglymetvalalaleuserglyileala100105110alaalaprovalglyleuilevalthralaglyleuleuglyvalala115120125glythralaproglyalailevalalaalaleuthrmetprovalgly130135140prothrvalthrvalmetglyproalametglyalavalglyglyser145150155160alavalvalalaalathrvalalaalavalproproglyalaileala165170175prothrvalleualaleuglythrglyalaleuvalalaglymetpro180185190glyalaalaalaalaglyalathrthrproproleuthralaglyala195200205alahisleuthrglyglyserglyproalailevalleuvalleuala210215220glyvalleuthrthrproalaalaglyvalleuglyglyvalthrala225230235240leuservalilealaalaalaglyalaproglyileglyvalalaval245250255glyprovalprovalglyleualathralacysalaglyilepromet260265270cysthrthralaglyglyilemetproilethrthrleualaglymet275280285provalalaglyglyglyileglyproilethrleuleuilethrala290295300glythrthralamethisthralaalaalathrserproglyileala305310315320thralaglyalaala325<210>5<211>978<212>dna<213>aspergillusterreus<400>5atggcttctatggacaaagttttcgctggttacgctgctcgtcaggctatcctggaatct60accgaaaccaccaacccgttcgctaaaggtatcgcttgggttgaaggtgaactggttccg120ctggctgaagctcgtatcccgctgctggaccagggtttcatgcactctgacctgacctac180gacgttccctctgtgtgggacgggaggttcttccgtctggacgaccacatcacccgtctg240gaagctagttgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggttaaacag300atcctggttgaaatggttgctaaatctggtatccgtgacgctttcgttgaactgatcgtt360acccgtggtctgaaaggtgttcgtggtaccgcgccggaagacatcgttaacaacctgtac420atgttcgttcagccatacgtgtgggtcatggaaccggacatgcagcgtgttggtggttct480gctgttgttgctcgtaccgttcgtcgtgttccgccgggtgctatcgacccgaccgttaaa540aacctgcagtggggtgacctggttcgtggtatgttcgaagctgctgaccgtggtgctacc600tacccgttcctgaccgacggtgacgctcacctgaccgaaggttctggtttcaacatcgtt660ctggttaaagacggtgttctgtacaccccggaccgtggtgttctgcagggtgttacccgt720aaatctgttatcaacgctgctgaagcgttcggtatcgaagttcgtgttgaattcgttccg780gttgaactggcttaccgttgcgacgaaatcttcatgtgcaccaccgctggtggtatcatg840ccgatcaccaccctggacggtatgccggttaacggtggtcagatcggtccgatcaccaaa900aaaatctgggacggttactgggctatgcactacgacgctgcttactctttcgaaatcgac960tacaacgaacgtaactaa978<210>6<211>978<212>dna<213>aspergillusterreus<400>6atggcttctatggacaaagttttcgctggttacgctgctcgtcaggctatcctggaatct60accgaaaccaccaacccgttcgctaaaggtatcgcttgggttgaaggtgaactggttccg120ctggctgaagctcgtatcccgctgctggaccagggtttcatgcactctgacctgacctac180gacgttccctctgtgtgggacgggaggttcttccgtctggacgaccacatcacccgtctg240gaagctagttgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggttaaacag300atcctggttgaaatggttgctaaatctggtatccgtgacgctttcgttgaactgatcgtt360acccgtggtctgaaaggtgttcgtggtacctgtccggaagacatcgttaacaacctgtac420atgttcgttcagccatacgtgtgggtcatggaaccggacatgcagcgtgttggtggttct480gctgttgttgctcgtaccgttcgtcgtgttccgccgggtgctatcgacccgaccgttaaa540aacctgcagtggggtgacctggttcgtggtatgttcgaagctgctgaccgtggtgctacc600tacccgttcctgaccgacggtgacgctcacctgaccgaaggttctggtttcaacatcgtt660ctggttaaagacggtgttctgtacaccccggaccgtggtgttctgcagggtgttacccgt720aaatctgttatcaacgctgctgaagcgttcggtatcgaagttcgtgttgaattcgttccg780gttgaactggcttaccgttgcgacgaaatcttcatgtgcaccaccgctggtggtatcatg840ccgatcaccaccctggacggtatgccggttaacggtggtcagatcggtccgatcaccaaa900aaaatctgggacggttactgggctatgcactacgacgctgcttactctttcgaaatcgac960tacaacgaacgtaactaa978<210>7<211>978<212>dna<213>aspergillusterreus<400>7atggcttctatggacaaagttttcgctggttacgctgctcgtcaggctatcctggaatct60accgaaaccaccaacccgttcgctaaaggtatcgcttgggttgaaggtgaactggttccg120ctggctgaagctcgtatcccgctgctggaccagggtttcatgcactctgacctgacctac180gacgttccctctgtgtgggacgggaggttcttccgtctggacgaccacatcacccgtctg240gaagctagttgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggttaaacag300atcctggttgaaatggttgctaaatctggtatccgtgacgctttcgttgaactgatcgtt360acccgtggtctgaaaggtgttcgtggtaccgatccggaagacatcgttaacaacctgtac420atgttcgttcagccatacgtgtgggtcatggaaccggacatgcagcgtgttggtggttct480gctgttgttgctcgtaccgttcgtcgtgttccgccgggtgctatcgacccgaccgttaaa540aacctgcagtggggtgacctggttcgtggtatgttcgaagctgctgaccgtggtgctacc600tacccgttcctgaccgacggtgacgctcacctgaccgaaggttctggtttcaacatcgtt660ctggttaaagacggtgttctgtacaccccggaccgtggtgttctgcagggtgttacccgt720aaatctgttatcaacgctgctgaagcgttcggtatcgaagttcgtgttgaattcgttccg780gttgaactggcttaccgttgcgacgaaatcttcatgtgcaccaccgctggtggtatcatg840ccgatcaccaccctggacggtatgccggttaacggtggtcagatcggtccgatcaccaaa900aaaatctgggacggttactgggctatgcactacgacgctgcttactctttcgaaatcgac960tacaacgaacgtaactaa978当前第1页12