一种锰过氧化氢酶在枯草芽孢杆菌表达体系构建方法与流程

本发明提供一种锰过氧化氢酶在枯草芽孢杆菌表达体系构建方法，尤其是一种能分泌表达锰过氧化氢酶gwc的重组枯草芽孢杆菌工程菌yoqh-rik1285-gwc的构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

过氧化氢酶广泛应用于食品、纺织、造纸和医药等行业，尤其在纺织工业中，因为过氧化氢酶具有减少污染、提高后续印染质量等优点而受到广泛应用。

已有文献《从土芽孢杆菌属sp.wch70中提取的一种新的含六聚体锰过氧化氢酶》发现了一种新型锰过氧化氢酶gwc，但其将gwc在大肠杆菌表达系统中进行表达，产量低下仅为5mg/l（经热处理和镍柱纯化），且需要一种较为昂贵的诱导剂iptg进行诱导表达。这两大劣势限制了其在工业生产中的应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种锰过氧化氢酶在枯草芽孢杆菌表达体系构建方法，解决了现有构建方法存在的表达产量低下仅为5mg/l，且需要一种较为昂贵的诱导剂iptg进行诱导表达的缺欠。

本发明所述的一种锰过氧化氢酶枯草芽孢杆菌工程菌的构建，包括以下步骤：

1）以嗜热菌geobacillussp.wch70的基因为模板，设计引物，通过pcr反应扩增3’端含有6个组氨酸标签的嗜热锰过氧化氢酶gwc基因；pcr引物，包括上游引物和下游引物（其序为seqid3、4）：

上游引物：5'ggaattccatatgtggatttatgaaaaaaaat3'；

下游引物:5'ccgctcgagttagtgatggtgatggtgatgaaaaattttattgcggt3'；

上游引物5'端catatg为ndeⅰ酶切位点，保护碱基ggaattc；

下游引物5'端ctcgag为xholⅰ酶切位点，保护碱基ccg；

2）将步骤1）得到的嗜热锰过氧化氢gwc基因为seqid1，酶切后与酶切后的穿梭质粒pbe-s连接，得到重组穿梭质粒pbe-s-gwc；

3）将步骤2）得到的重组穿梭质粒pbe-s-gwc酶切后与信号肽文库spdna-mix通过同源重组连接，得到质粒文库pbe-s-gwc-sp；

4）将质粒文库pbe-s-mncat-sp转化到枯草芽孢杆菌表达宿主rik1285中，选取携带48种不同信号肽的重组菌株进行表达，sds—page蛋白电泳图见图1，随后筛选出蛋白分泌能力最高的重组枯草芽孢杆菌是由信号肽yoqh所协助，yoqh为seqid2，即得锰过氧化氢酶工程菌yoqh-rik1285-gwc。

本发明的积极效果在于：提供了一种新的构建锰过氧化氢酶枯草芽孢杆菌工程菌方法，使枯草芽孢杆菌yoqh-rik1285-mncat分泌的嗜热锰过氧化氢酶达到0.74mg/l，比现有技术常用的大肠杆菌表达体系提高了48%，且只有少量包涵体产生。同时，不需改变培养温度、转速等条件，培养条件简单；特别是整个表达过程中不需加入诱导剂iptg，还能够高效地分泌蛋白，极大地节约了发酵成本；具有积极的实用价值。

附图说明

图1为携带48种不同信号肽的重组菌株表达锰过氧化氢酶sds—page蛋白电泳图；

图2为锰过氧化氢蛋白纯化sds-page电泳图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施例中所使用的耗材、试剂、仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中蛋白含量的测定使用的仪器为nanodrop微型分光光度计检测蛋白浓度。

实施例1：

锰过氧化氢酶gwc枯草芽孢工程菌的构建及酶的表达

1、引物设计及用pcr方法获取锰过氧化氢酶gwc的基因片段；

以嗜热菌geobacillussp.wch70的基因组为模板，设计引物，通过pcr方法扩增锰过氧化氢酶gwc的基因片段，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化，测序表明，该片段的大小为570bp；

上游引物：5'ggaattccatatgtggatttatgaaaaaaaat3'；

下游引物:5'ccgctcgagttagtgatggtgatggtgatgaaaaattttattgcggt3'；

pcr反应体系如下：（引物浓度为20μmol/l）

geobacillussp.wch70基因组dna1μl

dntpmixture4μl

上游引物1μl

下游引物1μl

10×pcrbuffer5μl

pcrtaq酶1μl

加水补至50μl；

pcr反应条件：94℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存，得到锰过氧化氢酶gwc基因如seqid1；

2、获取穿梭重组质粒pbe-s–mncat

将seqid1序列的dna片段，用ndeⅰ和xholⅰ双酶切，与经过ndeⅰ和xholⅰ双酶切的穿梭载体pbe-s的骨架片段进行过夜连接，获得重组载体pbe-s-mncat，经过测序证实，重组载体为在载体pbe-s的ndeⅰ和xholⅰ位点间插入序列表序列；

酶切体系如下（20μl）：

基因17μl；

10×hbuffer2μl；

ndeⅰ0.5μl；

xholⅰ0.5μl；

连接体系如下（20μl）；

酶切后gwc基因dna12μl；

酶切后pbe-s5μl；

10×t4dna连接酶buffer2μl；

t4dna连接酶1μl；

3、获取重组质粒文库pbe-s-gwc-sp

使用限制酶mlui和eco52i完全消化pbe-s–mncat；通过将spdna-mix混合物和限制酶消化的表达质粒以2:1的摩尔比混合来制备in-fusion反应溶液；

连接体系如下：

线性化pbe-s–gwc100ng；

sp-dna0.5μl；

5xin-fusionhdenzymepremix2μl；

h2oupto10μl；

使混合物在50℃下孵育15分钟，然后在冰上孵育,在使用前立即在冰上解冻大肠杆菌hst08感受态细胞。解冻细胞后，轻轻搅拌均匀，并将100μl感受态细胞转移到圆底试管中；将2μlin-fusion反应溶液加入管中,在冰上孵育30分钟,在42℃孵育45秒,在冰上孵育1-2分钟,将soc培养基预热至37℃，加入soc培养基。在37℃下以160-225rpm摇动1小时，在含有氨苄青霉素（100μg/ml）的lb平板上涂抹合适的体积；在37℃孵育过夜，在lb中从盘中悬浮菌落并收获后，纯化质粒以产生质粒文库；

4、将质粒文库导入rik1285及表达效果最佳的重组菌株

（1）枯草芽孢杆菌rik1285感受态的制备

1）将宿主菌株rik1285的甘油储备物适量放入lb平板上，37℃孵育过夜（约16小时）；

2）将2mllb培养基接种于lb板上孵育过夜的宿主菌株的环。在28℃下培养一夜（约16小时），以150-180rpm摇动；

3）将50μl培养液加入5mlspi培养基中，37℃，170〜180rpm；

spi培养基（每10ml）

（nh4）2so40.02g；

k2hpo40.14g；

kh2po40.06g；

na-citrate·2h200.01g；

mgso4·7h2o0.002g；

50%葡萄糖100μl；

酵母提取物100μl；

4）从培养开始1小时开始，每30分钟测量od660，一旦培养进入平台期，停止培养；

5）将0.5ml培养液加入4.5mlspii培养基中，37℃，90-100rpm下孵育90分钟；

spi培养基5ml

50mmcacl250μl

250mmmgcl250μl

6）向培养基中加入50μl的100mmegta，并在37℃，90-100rpm下振荡5-10分钟；

7）将上一步骤制备的溶液每300μl分成一管，以备转化；

8）每1000μl在i制备的感受态细胞中加入1μgdna溶液；

9）在30℃，90-100rpm下孵育90分钟；

10）在含有卡那霉素（10μg/ml）的lb平板上培养培养液，在37℃孵育过夜；

（2）筛选表达量最高重组工程菌株：

1）将上步骤中获得的lb平板上生长的重组菌株接种至含50mllb（10μg/ml培养基的250ml锥形瓶；

2）通过对菌株基因测序，筛选出携带48种不同信号肽的重组工程菌；

3）将48种重组工程菌进行蛋白表达，筛选出蛋白表达量及酶活最佳的重组工程菌是由信号肽yoqh所协助（48种不同信号肽的重组菌株表达锰过氧化氢酶的sds—page蛋白电泳图如图1所示），并将其命名为：yoqh-rik1285-gwc。

试验例1：

1、锰过氧化氢酶gwc的表达（蛋白的制备）

制备种子液：将筛选出的重组菌株接种yoqh-rik1285-gwc至含5mllb试管内，180rpm过夜培养。随后取部分菌液测序已确定携带信号肽序列，剩余菌液以4‰（v/v）接种至装有20ml种子培养基的50ml锥形瓶中，37℃、170r/min振荡8h至od600=6.0，获得种子液；所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；培养基的ph值为7.0。

发酵培养：取种子液以4‰（v/v）的接种量接种至装有2l发酵培养基的5l的锥形瓶中；先37℃、200r/min振荡培养48h，获得发酵液。

所述发酵培养基与前面所述的种子培养基成分相同（均为lb培养基，种子培养基20ml，发酵培养基2l）。

将上述步骤中所获得发酵液6000r/min离心10min，弃上清，收集菌体（1l菌液收集一管，放入-20℃保存）；从该菌体中分离锰过氧化氢酶，具体方法如下：

缓冲液10×tris-hcl（200mm）的配方：取24.2gtris-base置于1l烧杯中，加入约800ml去离子水充分搅拌溶解，用1mol/lhcl调ph至8.0，将溶液用容量瓶定容至1l，4℃保存。使用时稀释10倍。

、锰过氧化氢酶纯化过程

将上一步骤中获得的工程菌按照1g/10ml的比例溶于20mm、ph8.0tris-hcl缓冲液中，置于冰上超声破碎30min，当菌液由粘稠状态变为透亮即可，4℃、18000r/min离心15min，收集上清蛋白液；将上清蛋白液放入60℃水浴锅中保温30min，4℃、18000r/min离心15min，收集上清蛋白液；将上清蛋白液通过镍柱亲和层析法处理，通过50mm咪唑-tris-hcl洗脱，得到洗脱蛋白液；洗脱蛋白液透析过夜得到的蛋白液即本发明所述的锰过氧化氢酶，蛋白纯化sds-page电泳图如图2所示，蛋白浓度通过nanodrop2000c测定，经测定通过信号肽优化的锰过氧化氢酶gwc在枯草芽孢杆菌中表达量为14.8mg（两升培养基）。

结论：经测定，重组工程菌株yoqh-rik1285-gwc能够高效地表达锰过氧化氢酶gwc。

试验例2：

锰过氧化氢酶gwc酶活测定

实施例制备的锰过氧化氢酶gwc的酶活测定方法具体如下：

底物的配制：1%过氧化氢。

实验组：在880µltris-hcl中加入20µl锰过氧化氢酶，70℃预热1min，加入100µl过氧化氢，1min内测定240nm的吸光度值。

锰过氧化氢酶的一个标准酶活单位（1u）定义为：在上述条件下，1min反应时间内使1µmol的过氧化氢分解转化为产物所需要的酶量。

结论：经测定由工程菌yoqh-rik1285-gwc表达的锰过氧化氢酶比活力达到6877u/mg。

本发明所测锰过氧化氢酶的性质研究，如无特殊说明，都是透析后的锰过氧化氢酶蛋白液；采用测活方法如无特殊说明，都是240nm处紫外吸收。

序列表

<110>吉林大学

<120>一种锰过氧化氢酶在枯草芽孢杆菌表达体系构建方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>570

<212>dna

<213>嗜热锰过氧化氢gwc基因(嗜热锰过氧化氢gwc基因)

<400>1

atgtggatttatgaaaaaaaattgcaatatcctgttcgtgtcagcacatgcaacccaaaa60

ttggcgaaatatttaattgaacagtatggaggtgcggatggagaactcgccgctgcgctt120

cgttatttaaatcaacgctactccatccctgataaagtagtcggtttgctcacagatatt180

ggaaccgaagaattagctcatttggaaatgattgcgacaatggtatacaaattaacaaaa240

gacgccaccctagaacagctgaaagaagcaggtcttgacgcacactatgtcgatcatgac300

cgcgctttattttatcataatgccgctggagttccatttacggcgacatacattcaagcg360

aaaggagacccaattgccgatttatatgaagatatcgctgccgaagaaaaagcgcgggca420

acctatcaatggattattaatatgagcgatgatccagatttaaacgatgggcttcgcttt480

ttacgtgaacgtgaaatcattcatgcccagcgttttcgcgaagcagtcgaaattttaaaa540

gaagagcgtgaccgcaagaaaattttttaa570

<210>2

<211>75

<212>dna

<213>信号肽yoqh序列(信号肽yoqh序列)

<400>2

acgcgtatgaaacgatttattttagttttatcctttttaagtattattgttgcctatccc60

attcaaacaaacgcc75

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(上游引物)

<400>3

ggaattccatatgtggatttatgaaaaaaaat32

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(下游引物)

<400>4

ccgctcgagttagtgatggtgatggtgatgaaaaattttattgcggt47