一种人上皮性卵巢癌细胞SHOV4及其应用的制作方法

本发明涉及一种人上皮性卵巢癌细胞shov4及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

卵巢癌是现阶段死亡率最高的妇科肿瘤，五年生存率只有30％-40％。卵巢癌中80％以上为上皮性卵巢癌。

目前的生物医学研究中使用的上皮性卵巢癌细胞模型绝大部分用的是skov3，a2780和ovcar3三种细胞株；其中，skov3细胞株来源于美国高加索人种，于1973年分离获得，最初分类认为是浆液型细胞。a2780细胞株来源于澳大利亚人种，于1982-1986年之间分离获得，其组织分型为卵巢内膜样细胞。ovcar3细胞株，来源于美国高加索人种，于1982年分离获得，其组织分型为高级别浆液性卵巢癌。然而，这三个细胞株都是建立在30-40年前，在体外已培养多年。有文献报道，其性质已与当初分离出来时相差甚远。

目前中国的人口大约为13.9亿(其中，汉族人口占比为91.51％)，占世界人口比例约26％。但是现阶段常用卵巢癌细胞系均来自国外人群。不同人群的基因序列、表达和修饰水平都不同。利用来自国外人群的肿瘤细胞所研究出来的结果，与我国人群的实际情况具有一定的差异。

因此，如果能够从汉族人群中分离获得上皮性卵巢癌肿瘤细胞系，对于研究卵巢癌，特别是研究中国人群的卵巢癌的发病机制，开发针对我国国人的精准治疗方案具有重要意义。

技术实现要素：

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种人上皮性卵巢癌细胞shov4，其中，所述人上皮性卵巢癌细胞shov4为人上皮性卵巢癌细胞系，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno:c2018195。

本发明另一方面提供了上述人上皮性卵巢癌细胞shov4的子代细胞系。

本发明还一方面提供了上述人上皮性卵巢癌细胞shov4在建立卵巢癌细胞模型中的应用，或者，在研究卵巢癌发生、卵巢癌发展或卵巢癌转移的细胞模型中的应用，或者在筛选治疗卵巢癌的药物中的应用。

本发明再一方面提供了上述人上皮性卵巢癌细胞shov4的子代细胞系在建立卵巢癌细胞模型中的应用，或者，在研究卵巢癌发生、卵巢癌发展或卵巢癌转移的细胞模型中的应用，或者在筛选治疗卵巢癌的药物中的应用。

本发明提供的人上皮性卵巢癌细胞shov4，是从中国汉族人群中分离获得的上皮性卵巢癌肿瘤细胞系，对于研究卵巢癌，特别是研究中国人群的卵巢癌的发病机制，开发针对我国国人的精准治疗方案具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4的细胞形态照片；

图2为本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4的细胞增殖实验结果；

图3为本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4的迁移能力检测结果；

图4为本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4的细胞克隆形成能力检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

关于本发明的研发目的，上面背景技术中已有阐明，现有技术中常用的卵巢癌细胞系均来自国外人群，利用来自国外人群的肿瘤细胞所研究出来的结果，与我国人群的实际情况具有一定的差异；因此，发明人希望能够从我国汉族人群中分离获得人卵巢癌肿瘤细胞系，以便更精准地研究中国人群的卵巢癌的发病机制。

由此，发明人从多名汉族的卵巢癌患者人群的样品中分离培养人上皮性卵巢癌肿瘤细胞系，终于分离出一株合格的细胞系，即下面即将叙述的人上皮性卵巢癌细胞shov4。

一、下面介绍本申请发明人从病人样品中分离获得本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4(中国典型培养物保藏中心保藏编号cctccno:c2018195)的操作过程。

新鲜卵巢癌肿瘤组织获取自一患者(汉族、女性、年龄60周岁)的手术切除右侧卵巢肿瘤组织，其病理分型为高级别浆液性卵巢癌，临床分期为ⅲb期。

将新鲜肿瘤组织剪碎成直径1-2mm的碎块，利用穿刺针注身入balb/c无胸腺的裸鼠前肢后侧皮下组织。待肿瘤生长，此肿瘤计为f1代。

待肿瘤长到直径0.5～1cm时，处死裸鼠，手术取出肿瘤。并将肿瘤组织剪碎成直径1～2mm的碎块，再次利用穿刺针注身入新的裸鼠前肢后侧皮下组织，待肿瘤生长，此肿瘤计为f2代。

待f2代肿瘤长到直径0.5～1cm时，以上述同样的方法接种到新的裸鼠，计为f3代。

待f3代的肿瘤长到直径0.5～1cm时，处死裸鼠，手术取出肿瘤。并将肿瘤组织剪碎成直径1～2mm的碎块，利用胶原酶、蛋白酶以及dna酶将组织消化成单个细胞。

收集单个细胞，重悬于含20％fbs的rpmi164培养基中，并于5％co2，100％湿度的细胞培养箱中培养和传代。

发明人再通过下面一系列的实验来检测上述收集到的细胞是否可以作为合格的卵巢癌细胞系。

最终，发明人将收集到的细胞命名为人上皮性卵巢癌细胞shov4。

二、细胞形态观察

将上述收集得到的细胞(人上皮性卵巢癌细胞shov4，下面简称shov4细胞)接种于10cm细胞培养板中，待其长到70％～80％密度时，置于倒置显微镜200倍下观察，并拍照记录细胞形态，参见图1。

从图1中可以看出，上述收集得到的shov4细胞包含有多种形态不同的细胞亚群，主要包括表皮样的细胞亚群和梭形的细胞亚群。由此可见，shov4很好地保存了卵巢癌肿瘤的异质性。

三、细胞增殖时间检测

从上述收集得到的shov4细胞(1000个)接种到96孔细胞培养板中，每隔一天将细胞消化下来，统计细胞的个数，连续计算8天。

根据计数的结果作图，结果参见图2，从图2中可以获知上述收集到的shov4细胞的倍增时间为24h～48h。

四、细胞迁移能力检测

将上述收集到的shov4细胞(50000个)重悬于200μl无血清的rpmi1640培养基中，加入到含孔径为8μm的transwell(购自falcon公司)上室中，置于24孔板；

向24孔板的每孔中加入700μl含10％fbs的rpmi1640。将24孔板放入细胞培养箱中继续培养约18h；

利用4％多聚甲醛于室温固定细胞30min；利用2％结晶紫染色30min；

利用棉棒刮除transwell上室内未迁移的细胞，于200倍显微镜下观察，并拍照，结果参见图3。

从图3中可以看出，大量的细胞迁移通过了transwell孔，表明上述收集到的shov4细胞具有良好的迁移能力。

五、细胞克隆形成能力检测

将上述收集到的shov4细胞(2000个)接种于6孔板中，总体积为2ml。并于co2培养箱中培养10天。

弃去培养上清，用4％多聚甲醛于室温固定细胞30min。

利用2％结晶紫染色30min。

洗净多余的结晶紫染液，拍照(结果参见图4)并记录克隆数量。

从图4可以看出，整个6孔板中形成了大量的克隆，由此可见，上述收集到的shov4细胞具有良好的克隆形成能力。

六、裸鼠皮下成瘤能力检测

将上述收集到的shov4细胞(1×10⁶或者5×10⁶个)重悬于含25％的基质胶的pbs中，总体积100μl。

利用注射器将其注射入balb/c无胸腺裸鼠前肢后侧背部皮下组织。

一个月后处死裸鼠，手术取出肿瘤，称量肿瘤重量，接种1×10⁶个shov4细胞所形成的肿瘤的重量约为0.4±0.29克；接种5×10⁶个shov4细胞所形成的肿瘤的重量约为0.32±0.18克。

上述结果可以说明，上述收集到的shov4细胞具有良好的裸鼠皮下成瘤能力。

七、裸鼠腹腔成瘤能力检测

将上述收集到的shov4细胞(1×10⁶或者5×10⁶个)重悬于含25％的基质胶的pbs中，总体积100μl。

利用注射器将其注射入balb/c无胸腺裸鼠腹腔。

一个月后处死裸鼠，手术取出所有肿瘤，置于6cm细胞培养皿中，记录肿瘤重量和数量，接种1×10⁶个shov4细胞所形成的肿瘤的重量约为0.27±0.24克；肿瘤数量约为9.3±8.4个。接种5×10⁶个shov4细胞所形成的肿瘤的重量约为2.63±0.18克；肿瘤数量约为19.5±0.7个。

上述结果可以说明，上述收集到的shov4细胞具有良好的裸鼠腹腔成瘤能力。

八、str(shorttandemrepeats，短串联重复)的分子生物学检测

将上述收集到的shov4细胞(1×10⁷个)用axygen的基因组抽提试剂盒提取dna。

采用20-str扩增方案进行dna扩增。

在abi3730xl型遗传分析仪上对str位点和性别基因(釉原蛋白amelogenin的基因)进行检测。下表1为shov4细胞的str检测结果(shov4细胞存在多等位基因)。

表1

发明人采用dsmztools进行细胞系比对，将上述表1中的数据与来自atcc，dsmz，jcrb和riken细胞库的3274个细胞系str数据进行对比，比对结果参见表2。

表2

根据表2的结果可以看出，shov4细胞的str分布与现有细胞库中3274个人的细胞系的一致性都小于0.8，表明在这3274个细胞系中未发现与shov4细胞的str位点一致的细胞系，由此可见，本发明的shov4细胞是一种尚未公开(尚未报道)的新细胞系。

综上所述，发明人从一中国汉族的卵巢癌患者样品中分离获得的本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4，无论从细胞形态观察、细胞增殖时间、细胞迁移能力和细胞克隆形成能力的检测结果来看，还是该细胞在裸鼠皮下成瘤能力和裸鼠腹腔成瘤能力的检测和str检测结果来看，本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4是一株尚未报道的合格的人上皮性卵巢癌细胞系。

本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4是从中国汉族人群中分离获得卵巢癌肿瘤细胞系，对于研究卵巢癌，特别是研究中国人群的卵巢癌的发病机制，开发针对我国国人的精准治疗方案具有重要意义。

本发明的人上皮性卵巢癌细胞shov4，属于人上皮性卵巢癌细胞系，已保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山；邮编：430072)，保藏日期为2018年10月10日，其保藏编号为cctccno:c2018195。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。