外周血CTL细胞的培养方法与流程

本发明涉及细胞培养
技术领域：
，具体而言，涉及一种外周血ctl细胞的培养方法。
背景技术：
：细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,ctl)，是一种特异性，具有杀伤功能的t细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。被激活的ctl能够产生特异性的肿瘤杀伤活性，这种细胞毒作用主要包括(1)穿孔素-颗粒酶途径(2)活化的ctl高表达fasl,通过与靶细胞表面fas抗原结合，可诱导靶细胞凋亡(3)分泌tnf等多种细胞因子直接杀伤靶细胞(4)产生多种趋化因子，吸引天然免疫细胞，杀伤靶细胞(5)释放多种丝氨酸酷酶，通过活化穿孔素而促进杀伤作用。细胞内感染和肿瘤的保护免疫主要依赖于细胞毒性t细胞(ctl)的应答，ctl对肿瘤细胞实施mhc限制性识别和特异性杀伤。体内外诱导、活化和扩增肿瘤反应性ctl是当前肿瘤免疫治疗研究的重大课题，具有巨大潜在意义。然而现有的ctl体外培育方法，普遍存在扩增ctl倍率低、细胞活性差等问题。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种新颖的外周血细胞毒性t细胞(cytotoxiclymphocyte,ctl)的培养方法，该方法操作简单，培养得到ctl质量较好，可用于ctl的大量制备，使该方法更利于推广和应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明涉及一种外周血ctl细胞的培养方法，包括：1)将由外周血分离得到的pbmc接种于包被有cd3抗体及cd28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为ifn-γ900u/ml～1100u/ml；2)向培养体系中加入il-1α和il-2，终浓度均为900u/ml～1100u/ml；培养体系中还加入有il-7，终浓度为4～6ng/ml；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为il-2900u/ml～1100u/ml，il-7，2～3ng/ml，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的vivo培养基。与现有技术相比，本发明的有益效果为：ctl扩增效果好，且活化的ctl占比更高、t-reg细胞占比更低。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为对本发明一个实施例培养得到的树突状细胞表面标志物进行检测的结果。具体实施方式本发明涉及一种外周血ctl细胞的培养方法，包括：1)将由外周血分离得到的pbmc接种于包被有cd3抗体及cd28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为ifn-γ900u/ml～1100u/ml；2)向培养体系中加入il-1α和il-2，终浓度均为900u/ml～1100u/ml；培养体系中还加入有il-7，终浓度为4～6ng/ml；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为il-2900u/ml～1100u/ml，il-7，2～3ng/ml，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的vivo培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为ifn-γ950u/ml～1050u/ml。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为ifn-γ1000u/ml。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养体系中加入il-1α和il-2的终浓度均为950u/ml～1050u/ml；加入il-7，终浓度为4.5～5.5ng/ml。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养体系中加入il-1α和il-2的终浓度均为1000u/ml；加入il-7，终浓度为5ng/ml。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为il-2950u/ml～1050u/ml，il-72.2～2.8ng/ml。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为il-21000u/ml，il-72.5ng/ml。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养容器包被有cd3抗体及cd28抗体的方法为：以所述培养面积为25cm2计，加入2.5～3.5ml含有cd3抗体400ng/ml～600ng/ml及cd28抗体400ng/ml～600ng/ml的包被液，在细胞培养条件下包被1.5h～2.5h。如非特别强调，本申请所述方法涉及到的细胞培养条件均在30至45℃之间和在1至10％的co2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的co2之间。加cd3，cd28的抗体是为了模拟t细胞的tcr激活和共刺激信号，是为了让t细胞活化进入到增殖的状态。在一些实施方式中，cd3抗体的浓度为500ng/ml。在一些实施方式中，cd28抗体的浓度为500ng/ml。在一些实施方式中，所述包被液的溶剂为d-pbs。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的vivo培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为8ml～12ml，细胞接种量为0.8×107～1.2×107。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为10ml，细胞接种量为1.0×107。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为20h～28h。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为24h。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为2d～4d。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为3d。在一些实施方式中，在步骤3)中，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的vivo培养基。在一些实施方式中，在步骤3)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的vivo培养基。在一些实施方式中，在步骤3)中，将细胞扩增2～3次。在一些实施方式中，步骤3)的培养时间为9d～11d。在一些实施方式中，步骤3)的培养时间为10d。在一些实施方式中，步骤3)具体包括：a)以培养面积为75cm2计，加入15～25ml培养基培养3d；b)换液，以培养面积为175cm2计，加入60ml～80ml培养基培养3d；c)换液，使用培养袋进行培养，加入300ml～400ml培养基培养4d。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1本实施例涉及一种外周血ctl的培养方法。1.外周血ctl细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度400ng/ml，cd28抗体浓度600ng/ml。2)ctl初始培养基：vivo培养基(含4％自体血浆)，ifn-γ900u/ml。3)ctl培养基：vivo培养基(含4％自体血浆)，il-2浓度1100u/ml，il-72ng/ml。2.外周血ctl培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入2.5ml包被液，置于培养箱中包被2.5h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的pbmc0.8×107，接种到t25培养瓶内，加10mlctl初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-1α和il-2，终浓度均为900u/ml，培养体系中还加入有il-7，终浓度为4ng/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加ctl培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加ctl培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlctl培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第14天，收获细胞。实施例2本实施例涉及一种外周血ctl的培养方法。1.外周血ctl细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度600ng/ml，cd28抗体浓度400ng/ml。2)ctl初始培养基：vivo培养基(含6％自体血浆)，ifn-γ1100u/ml。3)ctl培养基：vivo培养基(含6％自体血浆)，il-2浓度900u/ml，il-73ng/ml。2.外周血ctl培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入3.5ml包被液，置于培养箱中包被1.5h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的pbmc1.2×107，接种到t25培养瓶内，加10mlctl初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-1α和il-2，终浓度均为1100u/ml，培养体系中还加入有il-7，终浓度为6ng/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加ctl培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加ctl培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlctl培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第14天，收获细胞。实施例3本实施例涉及一种外周血ctl的培养方法。1.外周血ctl细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度450ng/ml，cd28抗体浓度550ng/ml。2)ctl初始培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ950u/ml。3)ctl培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1050u/ml，il-72.2ng/ml。2.外周血ctl培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入2.8ml包被液，置于培养箱中包被2.2h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的pbmc1.1×107，接种到t25培养瓶内，加10mlctl初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-1α和il-2，终浓度均为1050u/ml，培养体系中还加入有il-7，终浓度为5.5ng/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加ctl培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加ctl培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlctl培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第14天，收获细胞。实施例4本实施例涉及一种外周血ctl的培养方法。1.外周血ctl细胞培养基1)包被液：d-pbs，cd3单抗浓度500ng/ml，cd28抗体浓度500ng/ml。2)ctl初始培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ1000u/ml。3)ctl培养基：vivo培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1000iuml，il-72.5ng/ml。2.外周血ctl培养细胞方法1)培养第0天，取t25培养瓶，加入3ml包被液，置于培养箱中包被2h，备用。取出包被好的t25培养瓶，倒去包被液，取制备好的pbmc1.0×107，接种到t25培养瓶内，加10mlctl初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-1α和il-2，终浓度均为1000u/ml，培养体系中还加入有il-7，终浓度为5ng/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。3)培养第4天，将细胞全部转移到t75，加ctl培养基20ml，置于37℃、5％co2培养箱中。4)培养第7天，将细胞转移到t175培养瓶中，加ctl培养基70ml，置于37℃、5％co2培养箱中。5)培养第10天，将细胞转移到培养袋中加入400mlctl培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。6)培养第14天，收获细胞，做流式检测；其结果如图1所示。对比例1外周血ctl培养细胞方法1)培养第0天，取制备好的pbmc1.0×107，接种到t25培养瓶(未经过包被)内，加10mlctl初始培养基，置于37℃、5％co2培养箱中。2)培养第1天，取出培养瓶，加入il-1α和il-2，终浓度均为1000u/ml；培养体系中还加入有il-7，终浓度为5ng/ml；加入cd3单抗浓度500ng/ml，cd28抗体浓度500ng/ml；将培养瓶重新置于37℃、5％co2培养箱中。其余步骤同实施例4。对比例2ctl细胞培养基替换为：1)ctl初始培养基：rpm1-1640培养基(含5％自体血浆)，ifn-γ1000u/ml。2)ctl培养基：rpm1-1640培养基(含5％自体血浆)，il-2浓度1000iuml，il-72.5ng/ml。其余培养条件同实施例4。实验例在收取实施例4及对比例1、2的细胞后，进行细胞计数，并通过流式细胞术对表型进行鉴定。每组重复六次，结果如下：组别细胞数实施例46.4×108对比例14.6×108对比例21.2×108**p＜0.05，vs实施例4。*p＜0.05，vs实施例4。从上述结果可以看出，在本申请的培养体系下，rpm1-1640培养基并不能很好地促进细胞的增殖，但其对ctl的分化无明显影响；而预先包被培养瓶，可以让后期接种的细胞完全接触到激活诱导因子，达到更好的激活诱导效果，因而能够得到更多的活化的ctl；并通过控制分化时机，降低t-reg细胞的比例。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12