一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用与流程

文档序号：17158140发布日期：2019-03-20 00:16阅读：1132来源：国知局

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用。

背景技术：

转氨酶是5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate,plp)依赖性酶，广泛存在自然界中，能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，在细胞的氮代谢过程中发挥着重要作用。转氨酶作为生物催化剂可用于催化制备手性胺类化合物，作为合成治疗糖尿病药物、心血管药物、神经类药物、抗高血压药物和抗感染药物的重要中间体。

根据pfam数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和d-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-at)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。另外转氨酶还具有较高区域选择性和立体选择性等优点。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力。

来自土曲霉(aspergillusterreus)的ω-at能催化(r)-(+)-α-甲基苄胺与酮酸反应生成苯乙酮，手性选择性为(r)型。ω-转氨酶的催化过程如下所示：

目前，关于分子改造ω-转氨酶提高其热稳定性的研究已有报道。例如：

授权公告号为cn105441404b的发明专利文献公开了ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，该发明利用温度因子结合能量优化策略对野生型ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，筛选得到的突变体的半失活温度高达40.9℃，比野生型酶提高2.9℃。

申请公布号为cn105950581a的发明专利申请文献公开了一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用，该发明根据ω-转氨酶的三维结构模型，分析蛋白质结构中b-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件disulfidebydesign对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；然后结合相应位点b-factor值，选择该蛋白的不稳定区域引入二硫键，设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点突变，pcr扩增、纯化后，筛选得到含有一个半胱氨酸的突变体，再以该突变体为模板，进行定点突变得到同时含有两个半胱氨酸的突变体，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；最后从所述定点突变文库中筛选效果较好的ω-转氨酶突变体。该方法ω-转氨酶突变体由土曲霉(aspergillusterreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。

申请公布号为cn107058256a的发明专利申请文献公开了ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用，该发明依据在自然进化过程中，同源蛋白质的氨基酸序列某些特定位置向蛋白质结构和功能有利的方面趋于一致的机制，利用生物信息学技术筛选出与待改造生物酶同源的序列，并进行序列一致性分析，确定待改造生物酶中与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为突变对象，进而利用定点突变技术进行改造。

虽然，通过上述分子改造方法获得的突变体在一定程度上提高了野生型ω-转氨酶的热稳定性，但是上述ω-转氨酶仍有待进一步提高。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用，利用蛋白质共进化网络指导ω-转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω-转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体。

具体技术方案如下：

一种ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.3所示。

第一种ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸，该ω-转氨酶突变体(l118a)的半失活温度为42.2℃，比野生型酶提高3.75.3℃；ω-转氨酶突变体(l118a)在40℃下的半衰期为20.6min，比野生型酶延长13.7min。

第二种ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，该ω-转氨酶突变体(l118t)的半失活温度为43.8℃，比野生型酶提高5.3℃；ω-转氨酶突变体(l118t)在40℃下的半衰期为26.0min，比野生型酶延长19.1min。

本发明还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。

本发明提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因，其核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.4所示。

其中，ω-转氨酶突变体的核苷酸序列变化情况为：将编码野生型ω-转氨酶第118位亮氨酸的密码子ttg分别突变为gcg和acc。

本发明还提供了一种所述基因的表达单元。

本发明还提供了一种所述表达单元的重组质粒。

本发明还提供了一种所述重组质粒的转化子。

在蛋白质进化过程中，一些相互作用的氨基酸残基之间存在一种“共进化”(co-evolving)模式，形成了所谓的“共进化网络”，即当一个氨基酸残基发生变异时，与其相关联一个或多个氨基酸残基也要发生相应的变异，以维持蛋白质整体的空间结构以及生物学功能。

本发明还提供了一种ω-转氨酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用ncbi数据库中的多重序列比对工具，获得与野生型ω-转氨酶同源的转氨酶家族序列；

(2)利用共进化互信息模型对转氨酶家族序列进行分析，得到转氨酶家族的共进化网络，将共进化网络投射到野生型ω-转氨酶上，并根据不同位点上氨基酸残基之间的互信息，筛选出影响野生型ω-转氨酶结构和功能的相关氨基酸位点，作为待突变的氨基酸残基位点；

(3)根据待突变的氨基酸残基位点，设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板，进行定点pcr扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；

(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的ω-转氨酶突变体。

进一步地，所述的野生型ω-转氨酶为分离自土曲霉(aspergillusterreus)的ω-转氨酶；得到的ω-转氨酶突变体对应的定点突变引物为：

l118a-f：5’-gcatttgttgaagcgatagtcacccg-3’；

l118a-r：5’-gcgggtgactatcgcttcaacaaatgcatc-3’；

或者，

l118t-f：5’-gggatgcatttgttgaaaccatagtcacccgcggtc-3’；

l118t-r：5’-gaccgcgggtgactatggtttcaacaaatgcatccc-3’。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用蛋白质内氨基酸共进化网络指导转氨酶的理性改造，在丙氨酸扫描基础上结合定点饱和突变，以获得热稳定性提高的突变体；获得的ω-转氨酶突变体的半失活温度为42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期为20.6min和26.0min，比野生型酶延长13.7min和19.1min。

(2)利用蛋白质共进化网络指导ω-转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω-转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体，有效增加突变成功的概率，提高筛选工作量，提高实验效率。

附图说明

图1为ω-转氨酶(pdbid：4ce5)与其同源蛋白家族序列利用蛋白质共进化网络互信息预测的重要位点图。

图2为质粒pet28a(+)-ω-at的基因图谱示意图。

图3为ω-转氨酶及其突变体的酶活检测结果。

图4为半失活温度的检测结果图。

图5为酶活半衰期的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1.共进化网络预测

蛋白质共进化对于洞悉功能蛋白质的作用过程和蛋白质结构具有重要意义。通过对蛋白质共进化的度量，可以找到对蛋白质结构和功能具有重要作用的残基位点。

具体步骤如下：

(1)将土曲霉(aspergillusterreus)ω-转氨酶的pdb文件(pdbid：4ce5)在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过blastp多序列比对，获得相关的蛋白质家族编号pfam:01063。

(2)以互信息(mutualinformation，mi)为基础，通过不同生物学特征，借助互信息推断蛋白共进化网站mistic(mutualinformationservertoinfercoevolution)，生成氨基酸残基共进化网络；

将蛋白家族pfam序号(01063)和ω-转氨酶的pdb文件(pdbid：4ce5)上传到mistic网站上，mistic网站的网址服务器为http://mistic.leloir.org.ar；选定参比序列(referencesequence)a3xii7_leebm/39-275，mistic网站会根据上述信息生成氨基酸残基共进化网络，将生成的蛋白质共进化网络映射到ω-at(pdbid：4ce5)上，根据蛋白质中氨基酸残基之间的相互作用关系预测突变氨基酸位点，包括互信息(mi)21，保守值1.1，累积互信息(cmi)501，邻近互信息(pmi)1924。结果如图1所示，筛选了8个氨基酸位点。

2.定点突变

首先，对在mistic软件中预测的氨基酸残基位点设计引物，定点突变成丙氨酸，突变体引物如表1。

表1突变体引物

pcr扩增：以野生型ω-转氨酶基因的pet28a-ω-opt-ta质粒为模板，分别进行定点突变。

50μl体系包括：primestarmaxpremix(2x)25μl，上下游引物各1μl，质粒模板1μl，灭菌超纯水22μl。

pcr扩增程序为：98℃变性1min，98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共循环30次；72℃延伸7min。1％的琼脂电泳检验pcr产物。

将pcr产物用dpni酶在37℃下酶解2h以消除野生模板。

消化体系：17μlpcr产物，2μlbuffer，1μldpni。消化产物在42℃热击90s转化入感受态细胞e.colidh5α，37℃，200r，孵育1h后，涂布含有卡那霉素(50μg/μl)的lb固体平板，于37℃培养12h得到带突变的克隆，测序并提取其质粒。

3.表达、纯化阶段

将测序正确的质粒转化入e.colibl21(de3)中，挑取单菌落接种至加有5mllb液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好菌液以1％比例(v/v)的接种量接种至含50μg/ml卡那霉素的200ml的lb培养基(lb培养基每升含胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节ph7.0)中，37℃、180r/min培养至od600值为0.4～0.6，加入适量体积的iptg(终浓度为0.5mmol/l)，然后在25℃、150r/min条件下诱导表达20h后收集菌体。

将收集的菌体用去离子水洗涤两次，用破胞缓冲液重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300w，工作3s，间歇6s，超声15min。破胞液于8000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有ω-转氨酶突变体的粗酶液。

用ni-nta亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。平衡柱子后经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，将获得的粗酶液、穿透液、各梯度洗脱液变性处理后跑sds-page蛋白电泳，进而确定目的蛋白，适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。

所用缓冲液配制如下：

20mm洗脱缓冲液：50mm磷酸二氢钠，300mm氯化钠，20mm咪唑，ph8.0；

50mm洗脱缓冲液：50mm磷酸二氢钠，300mm氯化钠，50mm咪唑，ph8.0；

100mm洗脱缓冲液：50mm磷酸二氢钠，300mm氯化钠，100mm咪唑，ph8.0；

250mm洗脱缓冲液：50mm磷酸二氢钠，300mm氯化钠，250mm咪唑，ph8.0。

野生型和突变体的酶活，如下图3所示；由图3可知，丙氨酸扫描阶段，l118a突变体酶活是野生型的2.5倍多，并对残基l118位点进行定点饱和突变获得突变体l118t，其酶活是野生型的3.5倍。

实施例2

1、定点突变以及表达、纯化阶段

对118位的氨基酸残基位点设计引物，定点突变成苏氨酸(t)，突变体引物如下：

l118t-f：5’-gggatgcatttgttgaaaccatagtcacccgcggtc-3’；

l118t-r：5’-gaccgcgggtgactatggtttcaacaaatgcatccc-3’。

后续pcr扩增和表达、纯化阶段的步骤与实施例1完全相同。

2.突变体热力学稳定性考察

1)半失活温度(t50¹⁰)是指酶在特定温度下孵育10min后，酶活力丧失一半的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。

分别将野生型ω-转氨酶和突变体ω-转氨酶在25、30、35、40、45、50、55℃水浴中，恒温10min后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，orgin8.0拟合计算半失活温度(t50¹⁰)。

结果如图4所示，实验结果表明，ω-转氨酶突变体l118a和l118t的t50¹⁰分别为42.2和43.8℃，比野生型酶分别提高3.7和5.3℃。

2)半衰期(t1/2)是指特定温度下酶活力丧失一半的时间，是表征酶热稳定性的另一个重要参数。

将野生型ω-转氨酶和突变体ω-转氨酶置于40℃恒温水浴中温浴不同时间，迅速取出置冰上10min，然后测定酶的残余比活力。

以时间为横坐标，以酶热处理一定时间后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，orgin8.0拟合计算半衰期(t1/2)。

结果如图5所示，实验结果表明，ω-转氨酶突变体l118a和l118t的t1/2分别为20.6和26.0min，比野生型酶分别延长13.7min和19.1min。

此说明，该突变体增强了该蛋白的热稳定性，减缓了酶的热失活速率，使得突变酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。

表2ω-转氨酶及其突变体热稳定性结果

3.突变酶动力学的测定

用磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)配制，不同浓度(0-3mmol/l)的底物(r)-α-mba和丙酮酸。200μl的反应体系中包括180μl底物溶液(0.25％dmso，0.1mmol/l辅酶plp)20μl纯酶液(约1mg/ml)。利用md190酶标仪检测波长245nm处od值随时间的变化曲线。以底物浓度[s]对反应速率[v]作图，通过非线性拟合计算相应的km和vmax值，然后根据kcat＝vmax/[e0]([e0]为酶初始浓度，单位mmol/l)，计算求得kcat和催化效率kcat/km。结果如表2所示。

表3动力学参数

序列表

<110>浙江科技学院

<120>一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用

<160>24

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>325

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metalasermetasplysvalphealaglytyralaalaargglnala

151015

ileleugluserthrgluthrthrasnprophealalysglyileala

202530

trpvalgluglygluleuvalproleualaglualaargileproleu

354045

leuaspglnglyphemethisseraspleuthrtyraspvalproser

505560

valtrpaspglyargphepheargleuaspasphisilethrargleu

65707580

glualasercysthrlysleuargleuargleuproleuproargasp

859095

glnvallysglnileleuvalglumetvalalalysserglyilearg

100105110

aspalaphevalglualailevalthrargglyleulysglyvalarg

115120125

glythrargprogluaspilevalasnasnleutyrmetphevalgln

130135140

protyrvaltrpvalmetgluproaspmetglnargvalglyglyser

145150155160

alavalvalalaargthrvalargargvalproproglyalaileasp

165170175

prothrvallysasnleuglntrpglyaspleuvalargglymetphe

180185190

glualaalaaspargglyalathrtyrpropheleuthraspglyasp

195200205

alahisleuthrgluglyserglypheasnilevalleuvallysasp

210215220

glyvalleutyrthrproaspargglyvalleuglnglyvalthrarg

225230235240

lysservalileasnalaalaglualapheglyilegluvalargval

245250255

gluphevalprovalgluleualatyrargcysaspgluilephemet

260265270

cysthrthralaglyglyilemetproilethrthrleuaspglymet

275280285

provalasnglyglyglnileglyproilethrlyslysiletrpasp

290295300

glytyrtrpalamethistyraspalaalatyrserphegluileasp

305310315320

tyrasngluargasn

325

<210>2

<211>978

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggccagtatggataaggtttttgcaggctatgctgcccgtcaagcaatcttagaaagt60

accgaaactacgaacccgtttgccaaaggaattgcctgggtcgaaggggaactcgttcct120

ttagctgaagcacgcattccactcctcgatcagggcttcatgcactccgatctgacctac180

gacgtaccgtctgtttgggatgggcgattttttcgtttagatgatcatattacacgcctg240

gaagcaagctgcaccaagctgaggctgcgtctacccttaccacgtgatcaagttaaacaa300

atcctggtggaaatggtcgcaaaatctggtattcgggatgcatttgttgaagcgatagtc360

acccgcggtcttaaaggggtgcgaggaacttgcccggaatgcatagtgaacaacctgtac420

atgtttgtgcagccgtacgtgtgggttatggagccggatatgcagcgcgtaggcggcagc480

gcagtggtggctaggaccgtccgccgggtaccaccgggcgctattgatccgaccgtcaag540

aatcttcagtggggtgatcttgttcgtggaatgtttgaagcggctgatcgtggcgcaaca600

tatcccttccttaccgacggcgatgcgcacctgactgaaggatcgggttttaatatagta660

ttagtcaaagatggcgtcctgtatacgccagatcgcggggtgctgcagggagtgactcgc720

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<213>人工序列(artificialsequence)

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