一种突变体DNA聚合酶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物学领域，特别是涉及一种突变体dna聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术：

传统的pcr是将样本中的dna提取纯化之后进行扩增，实际应用时，提取纯化dna需要消耗大量的时间，并且可能导致目的基因的丢失，所以市场更需要能够用于直接扩增样本的taqdna聚合酶。而未经dna提取纯化的样本中含有很多抑制剂会严重抑制pcr反应，含有较强抑制剂的样本主要包括血液、土壤等。其中的抑制剂主要作用于taqdna聚合酶，主要是通过降低酶的延伸速度，也有报道说主要是与dna聚合酶的失活或靶dna和引物的捕获或降解相关。

用血液进行直接pcr广泛应用于诊断和法医分析，例如：遗传病的诊断、微生物和病毒感染的诊断、血型分析、环境检测、人类dna鉴定等。血液对pcr有很强的抑制作用，目前广泛使用的taqdna聚合酶在0.2％的全血液存在下就不能扩增了。因此，需要对上述抑制剂更具抗性且适用于使用血样的pcr反应的试剂，如dna聚合酶。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供一种突变体dna聚合酶及其制备方法和应用。

本发明的第一方面，提供一种分离的突变体dna聚合酶，其特征在于，所述突变体dna聚合酶为如下(1)或(2)的蛋白质：

(1)氨基酸序列如seqidno：2所示的蛋白质；

(2)与(1)中所述蛋白质具有至少80％同源性，且能在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中发挥dna聚合酶功能。

本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码如本发明的第一方面所述的突变体dna聚合酶。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如本发明的第二方面所述的分离的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞所述细胞含有如本发明的第三方面所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的如本发明的第二方面所述的分离的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供一种制备如本发明的第一方面所述的突变体dna聚合酶的方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养如本发明的第四方面所述的宿主细胞，使之表达所述突变体dna聚合酶。

本发明的第六方面，提供一种如本发明的第一方面所述的突变体dna聚合酶的纯化方法，包括如下步骤：

(i)将表达目的蛋白的宿主细胞离心，重悬后用溶菌酶进行处理；

(ii)水浴，离心，弃沉淀，收集上清液一；

(iii)去除上清液一中的核酸和其他杂质，离心，收集上清液二；

(iv)加入离子交换柱缓冲液，过滤，过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，进行蛋白质的分离，得到目的蛋白。

本发明的第七方面，提供一种如本发明的第一方面所述的突变体dna聚合酶在扩增靶核酸中的用途。所述靶核酸包含在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中。

本发明的第八方面，提供一种扩增靶核酸的方法，该方法包括：扩增时采用的dna聚合酶为如本发明的第一方面所述的突变体dna聚合酶。

本发明的第九方面，提供一种用于扩增靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(i)权利要求1所述的突变体聚合酶和(ii)一种或多种选自下组的试剂：缓冲液、金属阳离子、延伸核苷酸、引物、探针、去污剂、检测剂、染料、荧光分子、抗凝剂和细胞裂解剂。

如上所述，本发明的一种突变体dna聚合酶及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明中的突变体dna聚合酶是将野生型klentaqdna聚合酶(氨基酸序列如seqidno：3所示)，klentaq密码子的476位谷氨酰胺突变为谷氨酸，使得突变体dna聚合酶的血液耐受性优于野生型，可用于免核酸提取的直接扩增pcr反应体系中，例如在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本种。在血液和/或血浆浓度达到25％时依然可以实现扩增。

附图说明

图1显示为本发明中的突变体dna聚合酶和野生型klentaqdna聚合酶在不同种类不同浓度抑制剂存在时的扩增电泳图，图中1-5分别是从高到低的5个浓度，c是不含抑制剂的对照组，m是marker。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。

本发明提供的分离的突变体dna聚合酶为如下(1)或(2)的蛋白质：

(1)氨基酸序列如seqidno：2所示的蛋白质；

(2)与(1)中所述蛋白质具有至少80％同源性，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，且能在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中发挥dna聚合酶功能。

本发明提供的分离的多核苷酸，编码本发明所述的突变体dna聚合酶。

进一步地，所述分离的多核苷酸的核苷酸序列如seqidno：1所示。

进一步地，所述的分离的多核苷酸的核苷酸序列与seqidno：1至少80％相同的序列。例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。

本发明提供的重组表达载体，含有本发明所述的分离的多核苷酸。

本发明提供的宿主细胞，含有本发明所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的如本发明所述的分离的多核苷酸。

本发明提供的本发明所述的突变体dna聚合酶的方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养如本发明所述的宿主细胞，使之表达所述突变体dna聚合酶。

本发明提供的本发明所述的突变体dna聚合酶的纯化方法，包括如下步骤：

(i)将表达目的蛋白的宿主细胞离心，重悬后用溶菌酶进行处理；

(ii)水浴，离心，弃沉淀，收集上清液一；

(iii)去除上清液一中的核酸和其他杂质，离心，收集上清液二。

(iv)加入离子交换柱缓冲液，过滤，过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，对蛋白质进行鉴定，得到目的蛋白。

所述纯化方法具有以下一个或多个特征：

1)步骤(i)中的重悬的方法是：使用8-12mmol/l磷酸盐缓冲液进行重悬。

2)步骤(i)中，用溶菌酶进行处理时，加入混合液一混合反应，

以混合液一的总体积为基准计，混合液一配方为：

溶剂为tris-hcl缓冲液。

具体地，所述tris-hcl缓冲液浓度为9～11mmol/l，ph值为8.0-8.5。

3)以离子交换柱缓冲液的总体积为基准计，步骤(iv)中离子交换柱缓冲液的配方为：

溶剂为hepes缓冲液。

具体地，所述hepes缓冲液浓度为10～30mmol/l，ph为7.5～8.0。

优选地，以混合液一的总体积为基准计，混合液一配方为：

溶剂为tris-hcl缓冲液。

具体地，所述tris-hcl缓冲液浓度为10mmol/l，ph值为8.2。

优选地，以离子交换柱缓冲液的总体积为基准计，步骤(iv)中离子交换柱缓冲液的配方为：

溶剂为hepes缓冲液。

具体地，所述hepes缓冲液浓度为20mmol/l，ph为7.9。

在一种实施方式中，所述步骤(iii)中去除上清液一中的核酸和其他杂质的方法，为向上清液中添加聚乙烯亚胺。

在一种实施方式中，所述蛋白质的鉴定方法，为进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

tris-hcl缓冲液：三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为tris)，hcl为盐酸，tris-hcl缓冲液的配制方法即：根据所需浓度的不同，向水中添加相应tris，再加入盐酸调节ph值，达到目标ph值。

hepes缓冲液：即用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。hepes缓冲液：根据所需浓度的不同，向水中添加相应4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

np-40：乙基苯基聚乙二醇(nonidetp40)。

本发明提供的所述突变体dna聚合酶在扩增靶核酸中的用途，所述靶核酸包含在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中。

本发明提供的组合物，包含本发明所述的突变体dna聚合酶和一种或多种选下组的试剂：缓冲液、金属阳离子、延伸核苷酸、引物、去污剂、检测剂和靶核酸。

本发明提供的扩增靶核酸的方法，为扩增时采用的dna聚合酶为本发明所述的突变体dna聚合酶。

进一步地，所述方法具有以下一个或多个特征：(i)所述方法为pcr的方法；(ii)所述试验样本为含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的试验样本。

本发明提供的用于扩增靶核酸的试剂盒，包含(i)权利要求1所述的突变体聚合酶和(ii)一种或多种选自下组的试剂：缓冲液、金属阳离子、延伸核苷酸、引物、探针、去污剂、检测剂、染料、荧光分子、抗凝剂和细胞裂解剂。

下面为具体实施例部分。

实施例1突变体dna聚合酶基因表达载体的制备

选取野生型klentaqdna聚合酶基因的质粒模板、突变引物和/或拼接序列，准备pcr反应体系，pcr反应体系为50μl，包括10×buffer(100mmkcl，100mm(nh4)2so4，200mmtris-hclph8.8，20mmmgso4，1％tritonx-100，1mg/mlbsa)5μl，10mmdntp0.5μl，突变引物(拼接引物)各125ng，1upfu酶，含50ng质粒模板1μl，加ddh2o至50μl。突变引物和拼接序列为人工合成的寡核苷酸，包含了需要突变的位点及需要插入位点的序列，且已经替换了所需要突变的碱基。pcr扩增的条件为95℃变性30s，循环周期为95℃，30s，55℃，1min，68℃，14min，25个循环。pcr反应结束后将反应管放在冰上使其温度≤37℃。然后加入1μl的限制性内切酶dpni放置在37℃的恒温箱中酶解1小时，消化掉原来未突变的模板。然后加入1μl的限制性内切酶dpni放置在37℃的恒温箱中酶解1小时，消化掉原来未突变的模板。经基因测序后，得到的核苷酸序列如seqidno.1所示，完成突变的taqdna聚合酶碱基序列与设计的突变序列完全一致。之后将突变好的taqdna聚合酶基因表达序列转化到表达载体pwb254中，把构建的表达重组质粒按照常规方法转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株的感受态细胞中(实验室保存)，得到突变型taqdna聚合酶基因工程菌。

点突变引物序列：

正向引物：aacatgcccgtccaaggc(seqidno：4)

反向引物：ggtgccttggacgggca(seqidno：5)

实施例2突变体dna聚合酶的表达和纯化

用iptg诱导12-14小时后，4000rpm，4℃条件下离心20min，收集菌体，用20ml的10mmol/l的磷酸盐缓冲液重悬2遍，用5mg/ml的溶菌酶室温处理10min。加入等体积的溶液二(溶液二的配方为：tris-hcl缓冲液10mmol/l，ph值为8.2；氯化钾10mmol/l；乙二胺四乙酸1mmol/l；苯甲基磺酰氟1mmol/l；丙三醇5％；吐温-200.5％；np-400.5％)，70水浴1.5小时，4℃，10000rpm，离心20min，弃沉淀，收集上清。用0.15％的pei常温处理10min，用于去除核酸和其他杂质，4℃，4000rpm，离心10min，收集上清，加入2倍体积的溶液三(溶液三的配方为：hepes缓冲液20mmol/l，ph为7.9；乙二胺四乙酸1mmol/l；苯甲基磺酰氟1mmol/l；丙三醇5％；吐温-200.5％；np-400.5％)。0.45μm滤膜抽真空过滤，脱气后过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，跑sds-page鉴定，n端测序鉴定，确定得到目的蛋白，即突变型taqdna聚合酶原液，检

测酶浓度为5mg/ml。

实施例3突变体dna聚合酶的表达和纯化

用iptg诱导12-14小时后，4000rpm，4℃条件下离心20min，收集菌体，用20ml的10mmol/l的磷酸盐缓冲液重悬2遍，用5mg/ml的溶菌酶室温处理10min。加入等体积的溶液二(溶液二的配方为：tris-hcl缓冲液9mmol/l，ph值为8.0；氯化钾9mmol/l；乙二胺四乙酸0.5mmol/l；苯甲基磺酰氟0.5mmol/l；丙三醇1％；吐温-200.1％；np-400.1％)，70水浴1.5小时，4℃，10000rpm，离心20min，弃沉淀，收集上清。用0.15％的pei常温处理10min，用于去除核酸和其他杂质，4℃，4000rpm，离心10min，收集上清，加入2倍体积的溶液三(溶液三的配方为：hepes缓冲液30mmol/l，ph为8.0；乙二胺四乙酸2mmol/l；苯甲基磺酰氟2mmol/l；丙三醇8％；吐温-201％；np-401％)。0.45μm滤膜抽真空过滤，脱气后过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，跑sds-page鉴定，得到目的蛋白，即突变型taqdna聚合酶原液，检测酶浓度为4.5mg/ml。

实施例4突变体dna聚合酶的表达和纯化

用iptg诱导12-14小时后，4000rpm，4℃条件下离心20min，收集菌体，用20ml的10mmol/l的磷酸盐缓冲液重悬2遍，加入等体积的溶液二(溶液二的配方为：tris-hcl缓冲液11mmol/l，ph值为8.5；氯化钾11mmol/l；乙二胺四乙酸2mmol/l；苯甲基磺酰氟2mmol/l；丙三醇8％；吐温-201％；np-401％)，用5mg/ml的溶菌酶室温处理10min。70水浴1.5小时，4℃，10000rpm，离心20min，弃沉淀，收集上清。用0.15％的pei常温处理10min，用于去除核酸和其他杂质，4℃，4000rpm，离心10min，收集上清，加入2倍体积的溶液三(溶液三的配方为：hepes缓冲液10mmol/l，ph为7.5；乙二胺四乙酸0.1mmol/l；苯甲基磺酰氟0.1mmol/l；丙三醇1％；吐温-200.1％；np-400.1％)。0.45μm滤膜抽真空过滤，脱气后过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，跑sds-page鉴定，得到目的蛋白，即突变型taqdna聚合酶原液，检测酶浓度为4.7mg/ml。

实施例4突变型taqdna聚合酶耐抑制作用实验

分别用人的血液、血浆、血清、血红蛋白、血红素、乳铁蛋白6中抑制剂，按照以下浓度梯度加入到反应体系中，扩增250bp的λdna基因：

血液浓度：25％、12％、6％、3％、1.5％

血浆浓度：25％、12％、6％、3％、1.5％

血清浓度：50μg/ml、25μg/ml、12μg/ml、6μg/ml、3μg/ml

血红蛋白浓度：2.5mg/ml、1.2mg/ml、0.6mg/ml、0.3mg/ml、0.15mg/ml

血红素浓度：6.4μm、3.2μm、1.6μm、0.8μm、0.4μm

乳铁蛋白浓度：60μm、30μm、15μm、7.5μm、3.8μm

图1中1-5分别是从高到低的5个浓度，c是不含抑制剂的对照组，m是marker。

从图1可以看出，突变型taqdna聚合酶在抑制剂存在时，扩增性能优于野生型klentaq1。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110>南京市胸科医院

<120>一种突变体dna聚合酶及其制备方法和应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1668

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tttggcagcctcctccacgagttcggccttctggaaagccccaaggccctggaggaggcc60

ccctggcccccgccggaaggggccttcgtgggctttgtgctttcccgcaagaagcccatg120

tgggccgatcttctggccctggccgccgccagggggggccgggtccaccgggcccccgag180

ccttataaagccctcagggacctgaaggaggcgcgggggcttctcgccaaagacctgagc240

gttctggccctgagggaaggccttggcctcccgcccggcgacgaccccatgctcctcgcc300

tacctcctggacccttccaacaccacccccgtgggggtggcccggcgctacggcggggag360

tggacggaggaggcgggggagcgggccgccctttccgagaggctcttcgccaacctgtgg420

gggaggcttgagggggaggagaggctcctttggctttaccgggaggtggagaggcccctt480

tccgctgtcctggcccacatggaggccacgggggtgcgcctggacgtggcctatctcagg540

gccttgtccctggaggtggccgaggagatcgcccgcctcgaggccgaggtcttccgcctg600

gccggccaccccttcaacctcaactcccgggaccagctggaaagggtcctctttgacgag660

ctagggcttcccgccatcggcaagacgaagaagaccggcaagcgctccaccagcgccgcc720

gtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatcgtggagaagatcctgcagtaccgggag780

ctcaccaagctgaagagcacctacattgaccccttgccggacctcatccaccccaggacg840

ggccgcctccacacccgcttcaaccagacggccacggccacgggcaggctaagtagctcc900

ggccccaacctccagaacatccccgtccgcaccccgcttgggcagaggatccgccgggcc960

ttcatcgccgaggaggggtggctattggtggtgctggactatagccagatagagctcagg1020

gtgctggcccacctctccggcgacgagaacctgatccgggtcttccaggaggggcgggac1080

atccacacggagaccgccagctggatgttcggcgtcccccgggaggccgtggaccccctg1140

atgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggggtcctctacggcatgtcggcccaccgc1200

ctctcccaggagctagccatcccttacgaggaggcccaggccttcattgagcgctacttt1260

cagagcttccccaaggtgcgggcctggattgagaagaccctggaggagggcaggaggcgg1320

gggtacgtggagaccctcttcggccgccgccgctacgtgccagacctagaggcccgggtg1380

aagagcgtgcgggaggcggccgagcgccgcgccttcaacatgcccgtccaaggcaccgcc1440

gccgacctcatgaagctggctatggtgaagctcttccccaggctggaggaaatgggggcc1500

aggatgctccttcaggtccacgacgagctggtcctcgaggccccaaaagagagggcggag1560

gccgtggcccggctggccaaggaggtcatggagggggtgtatcccctggccgtgcccctg1620

gaggtggaggtggggataggggaggactggctctccgccaaggagtga1668

<210>2

<211>554

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

glyserleuleuhisglupheglyleuleugluserprolysalaleu

151015

gluglualaprotrpproproprogluglyalaphevalglypheval

202530

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354045

alaargglyglyargvalhisargalaprogluprotyrlysalaleu

505560

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65707580

leualaleuarggluglyleuglyleuproproglyaspasppromet

859095

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100105110

alaargargtyrglyglyglutrpthrgluglualaglygluargala

115120125

alaleusergluargleuphealaasnleutrpglyargleuglugly

130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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290295300

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<400>5

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