盐胁迫诱导型启动子及其引物、表达载体和应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及盐胁迫诱导型启动子及其引物、表达载体和应用。

背景技术：

我国长江以北及大部分的沿海地区，土壤中的盐碱含量往往过高，容易危害植物生长，尤其对作物的产量会造成显著影响。近年来，随着生物技术的迅猛发展，作物基因工程逐步成为改良作物性能、提高作物品质的快速方法。在过去的20年间，利用基因工程技术改造了不少植物，使得改造之后的植物对盐胁迫的耐受力增强；然而，也有一些转基因植物经改造之后产生了不良的副作用，出现了延缓生长、植株矮小，产量降低等问题，这些问题可能是由于组成型启动子驱动的能量消耗、高水平的转基因表达和转基因的异位表达造成的结果。启动子作为识别、结合rna聚合酶并控制着转录起始的一段dna序列，它控制着基因的表达时间和表达程度，对基因的活动起着“分子开关”的作用。因此，在植物的基因工程领域中，亟待为转基因作物能够更好地耐受多种非生物胁迫，提供一种可替代的胁迫诱导型启动子。

技术实现要素：

根据以上技术问题，本发明的目的是提供盐胁迫诱导型启动子及其引物、表达载体和应用，以解决转基因植物经改造之后出现延缓生长、植株矮小和产量降低的问题，提高对盐胁迫的耐受力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种盐胁迫诱导型启动子1，所述启动子具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

一种具有盐胁迫诱导型启动子1的表达载体，所述表达载体为atlhr1821pro::gus。

构建所述的表达载体atlhr1821pro::gus的引物分别如序列表中seqidno：4、7、8、9所示。

一种盐胁迫诱导型启动子2，所述启动子具有如seqidno：2所示的核苷酸序列。

一种具有盐胁迫诱导型启动子2的表达载体，所述表达载体为atlhr11380pro::gus。

构建所述的表达载体atlhr11380pro::gus的引物分别如序列表中seqidno：5、7、8、9所示。

一种盐胁迫诱导型启动子3，所述启动子具有如seqidno：3所示的核苷酸序列。

一种具有盐胁迫诱导型启动子3的表达载体，所述表达载体为atlhr12340pro::gus。

构建所述的表达载体atlhr12340pro::gus的引物分别如序列表中seqidno：6、7、8、9所示。

上述盐胁迫诱导型启动子1或2或3在盐胁迫诱导下驱动目的基因表达的应用。

进一步地，所述应用是在拟南芥盐胁迫诱导下驱动目的基因表达。

进一步地，所述目的基因是gus基因。

具体操作步骤如下：

1.启动子序列及作用元件分析

在拟南芥官网(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)找到lhr1基因，从lhr1基因的起始密码子上游截取取长度为2340bp的片段作为拟南芥lhr1基因的启动子；利用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/网站分析这段序列的作用元件，根据作用元件的分布，进一步将该片段进行分段研究。

2.启动子片段克隆

以拟南芥基因组dna为模板，用高保真酶(takara，japan)对启动子片段进行pcr扩增(10xbuffer5μl，dntp4μl，primer-f引物1μl，primer-r引物1μl，模板1μl，酶1μl，rnase-freewater补足50μl；程序：98℃10″，55℃15″，72℃30″，30circle；16℃，hold)。将扩增完成的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段后连接至peasy克隆载体，转化大肠杆菌后37℃恒温培养12小时。

3.构建启动子片段的载体

采用pbi101接gus报告基因的载体，用内切酶salⅰ和xbaⅰ对质粒和片段进行酶切，在22℃条件下用t4连接酶(thermo，usa)将启动子片段连接至载体片段的多克隆位点(mcs)区域，构建重组质粒，载体构建图谱如附图1。启动子片段插入mcs后导入大肠杆菌，大量扩增重组质粒，挑取单菌落，利用设计在pbi101::gus载体多克隆位点上下游的引物对菌落进行pcr验证，检测是否有启动子片段成功插入pbi101::gus载体的阳性菌落产生，挑取阳性菌落于lb液体培养基震荡培养过夜，提取阳性菌液的质粒，保存至-20℃。

4.拟南芥遗传转化

将重组质粒导入农杆菌gv3101，pcr鉴定阳性菌落。在转化前的第二天晚上挑取阳性单克隆于2mlyeb液体培养基中震荡培养，转化前的第一天晚上以1：300扩大培养过夜使农杆菌接近饱和状态，取300ml菌液，4000r/min室温离心10min；弃上清，加入35ml10mmmgso4溶液，重悬菌体后，4000r/min室温离心10min；弃上清，加入5ml10mmmgso4，重悬菌体后，加入5μl200mm乙酰丁香酮(as)，室温放置2h；在5ml菌液中加入100mlms渗透培养基，摇匀后倒入盘内，将ler野生型拟南芥的花序浸泡在渗透培养基中1-2min；材料浇水后封一层保鲜膜保湿，将植物放入24℃暗室中过夜；第二天揭膜放在生长室内正常生长。

5.拟南芥抗性材料的筛选、检测

将转化拟南芥后得到的种子进行消毒，将消毒后的种子铺在含30mg/lkanamycin的1/2ms培养基上进行筛选，每块板子大约铺200粒种子；在4℃低温处理2-3天后放入生长室正常生长，两周左右通过肉眼便可看出抗性苗生长正常，而非抗性苗会慢慢变黄，直至死亡。

提取抗性苗的dna，利用设计在pbi101::gus载体多克隆位点上下游的引物分别对抗性苗的dna进行pcr检测，分别以质粒dna作为阳性对照，确定已插入启动子片段的转基因植株。

6.gus染色

以35s启动子启动gus基因表达的材料为阳性材料，将得到的转基因材料带根拔起，分别在1/2ms和1/2ms200mmnacl处理5h，处理完毕后加入gus染液，使染液能够淹没材料，500-700mmhg真空抽气，直至材料沉至容器底部，37℃培养箱中放置过夜。第二天将材料从37℃培养箱中取出，回收gus染液，再加入75％乙醇进行脱色，待叶片上的叶绿素被乙醇完全脱去后观察gus染色情况，并拍照。

7.rt-qpcr检测gus基因的表达情况

取生长三周左右的拟南芥材料，将材料分别在1/2ms和1/2ms200mmnacl处理5h，用trizol分别提取正常生长和200mmnacl处理5h的拟南芥材料的rna，各两管，用分光光度计测量rna的质量和浓度后，用反转录试剂盒(thermo，usa)将rna反转为cdna(rna1000ng，5xbuffer4μl，dntp2μl，ri1μl，rtμl，rnase-freewater补足20μl)，用atactin2引物检测cdna是否反转成功，将反转成功的cdna保存至-20℃。定量引物序列如序列表中seqidno：6-9所示。将反转成功的cdna稀释10-20倍，上样至96孔板，每个孔上样：8.8μlcdna，0.6μlq-gus-f，0.6μlq-gus-f，10μl2xfaststartuniversalsybrgreenmaster(rox)；pcr反应程序：95℃3min，(95℃10s，60℃30s)40circle，每个样品在同一块96孔板上做三个重复。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用拟南芥基因组dna克隆得到启动子片段，构建接gus报告基因的载体，转化ler野生型拟南芥，得到能够稳定遗传的植株之后，在正常条件和盐胁迫条件下，对启动子片段的驱动效率进行研究，确定启动子能驱动gus基因在拟南芥根、茎、叶、花等各个部位表达，且在盐胁迫条件下启动子的活性与驱动效率比在正常条件下要高，本发明所提供的启动子能使转基因作物提高耐盐性，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1启动子片段的载体构建图谱。

图2启动子质粒的双酶切验证，泳道m为maker；泳道5为salⅰ和xbaⅰ双酶切atlhr1821pro::gus质粒，泳道6为atlhr1821pro::gus质粒；泳道7为salⅰ和xbaⅰ双酶切atlhr11380pro::gus质粒，泳道8为atlhr11380pro::gus质粒；泳道9为salⅰ和xbaⅰ双酶切atlhr12340pro::gus质粒，泳道10为atlhr12340pro::gus质粒。

图3转基因材料筛选。

图4gus染色结果。

图51/2ms处理后gus基因的表达情况。

图61/2ms+200mmnacl处理后gus基因的表达情况。

具体实施方式

实施例1启动子片段的作用元件分析

由http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/分析从tair网站得到的lhr1基因的启动子序列，发现该段序列除了具备核心启动子元件，如tata-box、caat-box、光响应和昼夜节律相关的元件以外，还具有与生物和非生物胁迫相关的启动子元件，如are元件是厌氧诱导所必需的顺式作用元件，ltr元件参与低温诱导，hse元件与热胁迫相关，tc-richrepeats参与胁迫与应激反应，cgtca-motif参与茉莉酸反应，gare-motif响应赤霉素诱导的反应等。

根据作用元件的分布情况，又将该片段进一步分为两段，长度分别为1380bp和821bp。

实施例2不同长度的盐胁迫诱导型启动子片段的克隆

以拟南芥基因组dna为模板，用高保真酶(takara，japan)对启动子片段进行pcr扩增(10xbuffer5μl，dntp4μl，primer-f引物1μl，primer-r引物1μl，模板1μl，酶1μl，rnase-freewater补足50μl；程序：98℃10″，55℃15″，72℃30″，30circle；16℃，hold)。将扩增完成的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段后连接至peasy克隆载体，转化大肠杆菌后37℃恒温培养12小时。

实施例3构建启动子片段的载体

采用pbi101接gus报告基因的载体，用内切酶salⅰ和xbaⅰ对质粒和片段进行酶切，在22℃条件下用t4连接酶(thermo，usa)将启动子片段连接至载体片段的多克隆位点(mcs)区域，构建重组质粒。启动子片段插入mcs后导入大肠杆菌，大量扩增重组质粒，挑取单菌落，利用设计在pbi101::gus载体多克隆位点上下游的引物对菌落进行pcr验证，检测是否有启动子片段成功插入pbi101::gus载体的阳性菌落产生，挑取阳性菌落于lb液体培养基震荡培养过夜，提取阳性菌液的质粒，保存至-20℃。成功构建了atlhr1821pro::gus、atlhr11380pro::gus和atlhr12340pro::gus载体，酶切验证如附图2。

引物序列为：

实施例4拟南芥遗传转化

将重组质粒导入农杆菌gv3101，pcr鉴定阳性菌落。在转化前的第二天晚上挑取阳性单克隆于2mlyeb液体培养基中震荡培养，转化前的第一天晚上以1：300扩大培养过夜使农杆菌接近饱和状态，取300ml菌液，4000r/min室温离心10min；弃上清，加入35ml10mmmgso4溶液，重悬菌体后，4000r/min室温离心10min；弃上清，加入5ml10mmmgso4，重悬菌体后，加入5μl200mm乙酰丁香酮(as)，室温放置2h；在5ml菌液中加入100mlms渗透培养基，摇匀后倒入盘内，将ler野生型拟南芥的花序浸泡在渗透培养基中1-2min；材料浇水后封一层保鲜膜保湿，将植物放入24℃暗室中过夜；第二天揭膜放在生长室内正常生长。

实施例5拟南芥抗性材料的筛选、检测

将转化拟南芥后得到的种子进行消毒，将得到的t0代种子在含有30mg/lkanamycin的1/2ms固体培养基上进行筛选。t1代仅仅只出现几株抗性苗(图3-a)，提取抗性材料的dna，用设计在载体多克隆位点两端的引物进行pcr鉴定，确定t1代转基因苗，将转基因移至营养土后单株收种；将t1代转基因材料的种子继续在30mg/lkanamycin抗性平板上进行t2代筛选，出现3:1的比例(图3-b)；再选几株t2代材料单株收种，继续在30mg/lkanamycin抗性平板上筛选，图3-c左边为t3转基因材料，右边为ler野生型，筛选至t3代，植株的后代已不再出现分离；由此证明，t2代转基因材料为纯合子。

实施例6gus染色

以35s启动子启动gus基因表达的材料为阳性材料，将得到的转基因材料带根拔起，分别在1/2ms和1/2ms200mmnacl处理5h，处理完毕后加入gus染液，使染液能够淹没材料，500-700mmhg真空抽气，直至材料沉至容器底部，37℃培养箱中放置过夜。第二天将材料从37℃培养箱中取出，回收gus染液，再加入75％乙醇进行脱色，待叶片上的叶绿素被乙醇完全脱去后观察gus染色情况，并拍照。在1/2ms生长条件下，启动子片段能够驱动gus基因的表达，并且能在根、茎、叶、花等各个部位表达。在200mmnacl处理条件下，启动子片段同样也能够驱动gus基因的表达，但是在经过盐处理之后，与未处理的材料相比，gus基因的表达更强，颜色更深，结果如图4所示。

实施例7rt-qpcr检测gus基因的表达情况

取生长三周左右的拟南芥材料，将材料分别在1/2ms和1/2ms200mmnacl处理5h，用trizol分别提取正常生长和200mmnacl处理5h的拟南芥材料的rna，各两管，用分光光度计测量rna的质量和浓度后，用反转录试剂盒(thermo，usa)将rna反转为cdna(rna1000ng，5xbuffer4μl，dntp2μl，ri1μl，rtμl，rnase-freewater补足20μl)，用atactin2引物检测cdna是否反转成功，将反转成功的cdna保存至-20℃。定量引物序列如序列表中seqidno：6-9所示。将反转成功的cdna稀释10-20倍，上样至96孔板，每个孔上样：8.8μlcdna，0.6μlq-gus-f，0.6μlq-gus-f，10μl2xfaststartuniversalsybrgreenmaster(rox)；pcr反应程序：95℃3min，(95℃10s，60℃30s)40circle，每个样品在同一块96孔板上做三个重复。qpcr结果显示启动子能够驱动gus基因的表达，qpcr结果与gus染色结果相吻合；并且启动子能够响应nacl的诱导，在200mmnacl处理后，提高了gus基因的表达。

qpcr引物序列为：

actin2-fatggctgaggctgatgatattcaac(seqidno：10)

actin2-rtctcagcaccaatcgtgatgacttg(seqidno：11)

q-gus-fttaactatgccggaatccatcgc(seqidno：12)

q-gus-raacgctgacatcaccattggc(seqidno：13)

上述的实验例结果表明，本发明的启动子片段能够驱动gus基因的表达，而且能在根、茎、叶、花等各个部位表达，在非生物胁迫诱导条件下启动子的活性与驱动效率也比在正常条件下要高，qpcr结果也显示出类似的结果，说明本发明所提供的启动子能使转基因作物提高耐盐性，具有广泛的应用价值。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>盐胁迫诱导型启动子及其引物、表达载体和应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>821

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>1

acaaaaaataaaaactcaagagtaagtcatatgatgtttcacttttaactgagattttca60

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<210>2

<211>1380

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>2

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<210>3

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<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

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<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcgtcgacacaaaaaataaaaactcaagagtaag34

<210>5

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gcgtcgacagttcctgctttagtagatacatcg33

<210>6

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gcgtcgacatttgactaatcctacttttgctc32

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cccaggctttacactttatgctt23

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ataaagacttcgcgctgatacc22

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

atggctgaggctgatgatattcaac25

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tctcagcaccaatcgtgatgacttg25

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ttaactatgccggaatccatcgc23

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

aacgctgacatcaccattggc21