甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对及检测方法与流程

本发明涉及生物检测
技术领域：
，特别涉及甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测引物对，还涉及甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测方法。
背景技术：
：甜瓜又可称为香瓜、哈密瓜等，属葫芦科，一年生蔓性，草本植物。温带至热带地区广泛栽培，中国各地栽培亦分布广泛。甜瓜的重要之处也在于它是中国最早利用为果品的瓜类，《齐民要术》中称之为小瓜。甜瓜栽培历史悠久，品种类别多样，为盛夏的重要果实，有很高的经济价值，其果肉可生食，可制成瓜干、瓜脯、罐头，也可加工成瓜酒、瓜酱、腌甜瓜等。甜瓜在人们的生活中占据着重要地位，但甜瓜的产量和品质却或多或少的受到一些病害的影响，从而使甜瓜种植产业的经济效益有所减损，其中甜瓜病毒病便是影响甜瓜生产较严重的一种病害。甜瓜坏死斑点病毒(melonnecroticspotvirus，mnsv)属于番茄从矮病毒科（tombusviridae）香石竹斑驳病毒属(carmovirus)，该病毒已在国内外的报道中被多次提及。甜瓜坏死斑点病毒于1960年在日本首次报道，之后陆续传播到美国、希腊、瑞典、意大利和突尼斯等国，2007年中国首次报道了mnsv的发生。现在病毒的检测方法主要有血清学及分子生物学检测法，如酶联免疫吸附法（elisa）、直接组织点免疫检测法（dtbia）、逆转录pcr（rt-pcr）、实时荧光定量pcr和lamp检测技术。目前，rt-lamp方法已证明是诸多病原菌检测较为高效、快捷的一项技术，已广泛应用于人、动物、植物、病原微生物等方面的基因检测，为农业及其他方面的生产、科学研究提供了便捷途径。运用该方法进行病毒检测，不仅节约经济成本，而且能够节省时间及人力。在甜瓜坏死斑点病毒检测技术的建立过程中所展现的创新思维，也可能为其它研究提供灵感与借鉴。但目前尚未有使用rt-lamp方法对甜瓜坏死斑点病毒进行检测的报道。技术实现要素：为了解决以上现有技术中甜瓜坏死斑点病毒rt-lamp方法的空白，本申请提供了甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测引物对。本发明还建立了甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测方法。本发明是通过以下步骤得到的：甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测引物对，外部引物对的核苷酸序列如下：mnsv-f3：5’-tcggctccgtttcaccta-3’，mnsv-b3：5’-acttccggtcgacagcatta-3’。内部引物对的核苷酸序列如下：mnsv-fip：5’-tggggagggggtcttgtgaatc-accggatctacttccactgg-3’，mnsv-bip：5’-tgctcattacgctgactcagcg-cctccacgtattgtcacacg-3’。检测引物对在进行非治疗目的的甜瓜坏死斑点病毒的检测中的应用。所述的应用，优选提取待检样品的总rna，使用含有权利要求1中的检测引物对的反应体系进行扩增反应。所述的应用，优选反应体系为25μl体系，含有浓度均为10μm的mnsv-fip和mnsv-bip引物各1.6μl，浓度均为10μm的mnsv-f3和mnsv-b3引物各0.2μl，12.5μl2×rt-lamp反应缓冲液，1μl的8u/μl的bstdna聚合酶，1μl200u/μl的m-mulv逆转录酶，1μl40u/μl的rnasin®rna酶抑制剂，2μlrna模板和不含rnase/dnase的ddh2o。所述的应用，优选2×rt-lamp反应缓冲液，含有40mmtris-hcl(ph8.8)、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、16mmmgso4、0.2％tritonx-100、2.4mmdntp和1.6m甜菜碱。所述的应用，优选扩增反应条件为62℃、60分钟。所述的应用，优选rna模板浓度检测限为0.75×10-5μg/μl。本发明的有益效果：1）建立了甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测方法，鉴于该法具有灵敏、可靠、快速的特点；2）rt-lamp对于检测mnsv是高度特异性的，而其他病毒没有获得扩增产物。检测结果的比较显示，rt-lamp对mnsv的敏感性比rt-pcr高103倍，而扩增和检测时间仅为后者的1/3；3）rt-lamp技术只需更简单的设备和材料，因此mnsv的rt-lamp检测技术在实际生产中具有更大的潜在价值，非常适合普通实验室和基层单位的大量样品检测。附图说明图1为mnsvrt-lamp反应条件的优化，（a）温度对rt-lamp反应的影响：（m：dl2000；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃）；（b）时间对rt-lamp反应的影响：（m：dl2000；1：30分钟；2：45分钟；3：60分钟；4：70分钟）；5：阴性对照。图2为mnsvrt-lamp的特异性检验，（a）琼脂糖凝胶电泳对rt-lamp的特异性分析；（b）在uv光下加入sybrgreeni后的rt-lamp可视化效果。m：dl2000；1：mnsv感染的甜瓜（寿光）；2：mnsv感染的甜瓜（昌乐）；3：cgmmv感染的黄瓜；4：cmv感染的黄瓜；5：ccyv感染的甜瓜；6：阴性对照。图3为mnsvrt-lamp和rt-pcr的比较，（a）使用连续稀释的总rna通过琼脂糖凝胶电泳对rt-lamp的灵敏度分析；（b）在uv光下添加sybrgreeni的rt-lamp可视化效果；（c）相同稀释度的总rnart-pcr琼脂糖凝胶检测结果。m：dl2000；1-8：mnsv感染甜瓜叶片中提取的总rna模板浓度从0.75×100至0.75×10-7μg/μl作倍比稀释；9：阴性对照。图4为24个田间样品的电泳检测结果，（a）rt-lamp方法检测结果；（b）rt-pcr方法检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：实施例11.1材料来源采集来自中国山东省寿光市、昌乐县感染甜瓜坏死斑点病毒（mnsv）的甜瓜叶片；已通过rt-pcr验证并储存在实验室中的黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus，cmv）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumbergreenmottlemosaicvirus，cgmmv）和瓜类褪绿黄化病毒(cucurbitchloroticyellowsvirus，ccyv）。1.2引物的设计以mnsv基因组中的保守序列（genbank登录号eu016217.1）为基础设计了一组rt-lamp引物，包括外部引物（mnsv-f3和mnsv-b3）和内部引物（mnsv-fip和mnsv-bip）。设计的一对特异性引物mnsv-f/mnsv-r用于常规rt-pcr扩增（见表1）。所有引物均由invitrogen（中国上海）合成。表1用于mnsv的rt-pcr和rt-lamp的引物设计引物名称长度位置序列(5’-3’)mnsv-f201-20tctacctctgctagcgaatcmnsv-r18656-673ggtgctaccagcaccagamnsv-f318397-414tcggctccgtttcacctamnsv-b320601-620acttccggtcgacagcattamnsv-fip42tggggagggggtcttgtgaatc-accggatctacttccactggmnsv-bip42tgctcattacgctgactcagcg-cctccacgtattgtcacacg1.3植物总rna的提取使用minibest通用rna提取试剂盒（takara，dalian，china）提取感染mnsv甜瓜叶片的总rna，并储存于-80℃以进行后续的rt-lamp和rt-pcr检测分析。1.4反应条件的初步建立rt-lamp反应在25μl体系进行，含有浓度均为10μm的mnsv-fip和mnsv-bip引物各1.6μl，浓度均为10μm的mnsv-f3和mnsv-b3引物各0.2μl，12.5μl2×rt-lamp反应缓冲液[40mmtris-hcl(ph8.8)，20mmkcl，20mm(nh4)2so4，16mmmgso4，0.2％tritonx-100，2.4mmdntp和1.6m甜菜碱（sigma-aldrich，st.louismo），1μlbstdna聚合酶（8u/μl，newenglandbiolabs，ma，usa），1μlm-mulv逆转录酶（200u/μl，promega，usa），1μlrnasin®rna酶抑制剂（40u/μl，promega，usa），2μlrna模板（阴性对照为无rna酶的水）和不含rnase/dnase的ddh2o。rt-lamp反应在61℃下进行60分钟，并在80℃下加热10分钟以终止反应，吸取5μl产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；在15μl反应物中加入0.2μlsybrgreeni（10x，invitrogen，usa），于365nm的紫外光下肉眼观察产物的颜色变化。在不同的反应温度（60℃，61℃，62℃和63℃）下反应1小时并且在62℃下设置不同的反应时间（30，45，60和70分钟），以确定最佳反应条件。从感染mnsv的甜瓜叶片中提取植物总rna，采用不同的反应时间和温度进行rt-lamp反应，以期得到最佳反应条件。琼脂糖凝胶电泳结果显示在60℃-63℃下均可得到许多大小不同的梯状条带（图1中a），鉴于条带在62°c时最亮，60分钟和70分钟时都可观察到有高浓度的弥散状产物（图1中b），因此选取62℃和60分钟为最佳反应条件。1.5rt-lamp的特异性分析从cgmmv和cmv感染的黄瓜叶片以及ccyv感染的甜瓜叶片组织中提取植物总rna，分别以上述三种病毒和mnsv的rna为模板，在最佳反应条件下进行rt-lamp检测。为了验证rt-lamp对mnsv的特异性，使用cgmmv和cmv感染的黄瓜叶片和ccyv感染的甜瓜叶片，分别在62℃下进行rt-lamp反应60分钟。电泳结果显示仅被mnsv感染的样品有弥散状条带，而被其他病毒感染的样品无任何条带（图2中a）。同时，将0.2μl的sybrgreeni加入到反应产物中，仅在mnsv感染的样品管中可见绿色，在其他样品管中未观察到颜色变化（图2中b）。1.6rt-lamp和rt-pcr检测技术的灵敏度分析为验证rt-lamp检测的灵敏度，将总rna的浓度以10倍系列稀释用作rt-lamp和rt-pcr的模板。使用primescriptii第一链cdna合成试剂盒（takara，dalian，china），按照说明手册使用反向引物（mnsv-r）进行逆转录，将得到的cdna2.5μl、引物mnsv-f和mnsv-r（10μm）各1μl以及2×taqpcrmastermix（天根，北京）混合至总体积25μl。于94℃5分钟；94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒进行30个循环，最后在72℃延伸10分钟。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来检测rt-lamp和rt-pcr的产物。比较rt-lamp和rt-pcr的检测限，将感染mnsv的甜瓜叶片总rna模板浓度进行10倍系列稀释（0.75×100至0.75×10-7μg/μl）。当模板浓度为0.75×10-5μg/μl时，通过凝胶电泳和sybrgreeni染色能够观察到rt-lamp反应（图3中a和3中b）；对于普通的rt-pcr方法，在模板浓度为0.75×10-2μg/μl时，通过凝胶电泳可以观察到预期的673bp目的片段；当模板浓度为0.75×10-3μg/μl时，rt-pcr已经检测不到病毒（图3中c）。因此，结果表明rt-lamp比rt-pcr灵敏高103倍。1.7田间样品的rt-lamp检测从山东省不同温室采集疑似感染mnsv的甜瓜叶片24份，分别提取植物总rna，所有样品在优化的反应条件下用rt-lamp和rt-pcr分别进行反应，其产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。通过两种方法检测24个疑似感染mnsv的rna样品来比较rt-lamp与rt-pcr的可靠性。结果显示，rt-lamp能够检测出24个样本中有21个为阳性（图4中a），检出率为87％；而通过rt-pcr只检测出18个样本为阳性（图4中b），检出率为75％。rt-lamp检测出的3个阳性样品而rt-pcr检测为阴性。另外，所有rt-pcr检测为阳性的样品rt-lamp检测也呈阳性。最近的研究表明，甜瓜坏死斑点病毒可以侵染许多国家的大部分葫芦科植物，从而对各国水果和蔬菜产业构成巨大威胁。因此，开发一种方便快捷的mnsv检测方法是极有必要的。与rt-pcr、qrt-pcr和elisa相比，rt-lamp在现场应用更为快速，简单，故本方案建立了一种mnsv的rt-lamp检测方法。rt-lamp用于mnsv的最佳条件为62℃加热或水浴60分钟。在uv光下加入sybrgreeni后观察扩增产物，rt-lamp对于检测mnsv是高度特异性的，而没有其他病毒获得扩增产物。检测结果的比较显示，rt-lamp对mnsv的敏感性比rt-pcr高103倍，而扩增和检测时间仅为后者的1/3。为了优化rt-lamp的反应条件，在之前关于植物病毒的rt-lamp检测报道中测试了不同的mg2+浓度，结果显示8mmmg2+在大多数情况下能够满足实验要求，因此一些病毒的rt-lamp直接使用该浓度进行检测而没有进行优化。然而，4mm和7mmmg2+也被报道用于优化的rt-lamp检测，这可能与病毒的类型和特异性有关。在本方案中，直接使用8mmmg2+并获得了良好的结果。由于lamp或rt-lamp与mg2+形成的焦磷酸镁沉淀物可能引起反应溶液变浑浊，因此可以在日光下通过肉眼直接观察，但是结果会受到自然光的强度、反应管的透明度和其他因素的影响。因此大多数rt-lamp仍通过琼脂糖凝胶电泳或uv光观察来确定，并且本方案也应用相同的判定方式。总之，本方案开发的一步rt-lamp检测技术是一种非常有价值的方法，具有大规模应用的潜能，尤其适用于现场对植物病毒的检测。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12