一种基于多位点联合评价杨树木材纤维长短的方法、引物组、试剂盒及其应用与流程

本发明属于植物分子育种技术领域，尤其涉及一种基于多位点联合评价杨树木材纤维长短的方法、引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

木材作为地球最丰富的可再生资源，对人类的生产与生活具有重要的工业与经济价值。杨树作为我国重要的用材树种，具有速生、优质、适应性强等特点。纤维形态是木材作为纸浆材质量评价的主要指标。其中，木材的纤维长度作为影响纸张强度和纸浆的质量的关键因子之一，是衡量木材作为纸浆材用材优劣的重要因素。

传统的对于木材纤维形态的研究主要是通过生理生化的方法来进行，随着现代分子育种技术的不断发展，从分子水平来进行木材纤维形态的研究，对杨树木材品质性状进行遗传改良，具有十分重要的理论及应用价值。然而，大多数集中在单个位点、单个基因、单一层次对木材纤维形状的研究。由于，林木的木材品质性状大多为数量性状，受到了多基因、多层次的协同调控作用，其遗传机制非常复杂，故仅对个别或少数基因进行遗传转化的研究是远远不够的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多位点联合评价杨树木材纤维长短的方法、引物组、试剂盒及其应用，可准确确定四个预定snp位点的基因型，进而科学地评价杨树木材纤维形态，在杨树生长的早期高效、准确地筛选木材品质良好的用材树种，缩短杨树材性育种周期。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种基于多位点联合评价杨树纤维长短的方法，包括以下步骤：1)测定杨树样品基因组dna中编码lncrna(longnon-codingrna)lnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基；确定杨树中上述4个位点的基因型组合；2)根据步骤1)中确定的基因型组合判断杨树样品纤维的长短；当编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基基因型为ct，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基基因型为ag，pto-po46基因内的171位碱基基因型为gt和pto-comt24基因内的613位碱基基因型为aa时，即当所述基因型组合为ct-ag-gt-aa时，杨树样品木材的纤维长度最长，当编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基基因型为ct，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基基因型为aa，pto-po46基因内的171位碱基基因型为gt和pto-comt24基因内的613位碱基基因型为ac时，即当所述基因型组合为ct-aa-gt-ac时，杨树样品木材的纤维长度最短。

优选的，所述杨树为毛白杨。

优选的，所述杨树样品基因组dna提取于杨树样品的功能叶。

本发明提供了基于所述方法检测杨树纤维长短的引物组，包括：

测定编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：1～3所示；

测定编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：4～6所示；

测定pto-po46基因内的第171位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：7～9所示；

测定pto-comt24基因内的第613位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：10～12所示。

本发明还提供了基于所述方法检测杨树纤维长短的试剂盒，包括所述引物组。

优选的，还包括pcr反应缓冲液，dntp，mgcl2，dna聚合酶和双蒸水。

本发明提供了所述的方法在杨树分子育种中的应用。

本发明提供了所述的引物组在杨树分子育种中的应用。

本发明提供了所述的试剂盒在杨树分子育种中的应用。

本发明的有益效果：本发明所述方法通过测定杨树样品基因组dna中编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基；确定杨树中上述4个位点的基因型组合；并根据确定的基因型组合判断杨树样品纤维的长短。本发明所述方法中的四个预定的基因位点是在全基因组水平上与毛白杨自然群体纤维长度性状显著关联的snp位点，能够准确地评价杨树木材纤维形态，在杨树生长的早期高效、准确地筛选木材品质良好的用材树种，缩短杨树材性育种周期。

附图说明

图1为本发明所述四个snp标记位点：编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基的不同基因型组合对杨树木材纤维长性状的基因型效应图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于多位点联合评价杨树纤维长短的方法，包括以下步骤：1)测定杨树样品基因组dna中编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基；确定杨树中上述4个位点的基因型组合；2)根据步骤1)中确定的基因型组合判断杨树样品纤维的长短；当编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基基因型为ct，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基基因型为ag，pto-po46基因内的171位碱基基因型为gt和pto-comt24基因内的613位碱基基因型为aa时，即当所述基因型组合为ct-ag-gt-aa时，杨树样品木材的纤维长度最长，当编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基基因型为ct，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基基因型为aa，pto-po46基因内的171位碱基基因型为gt和pto-comt24基因内的613位碱基基因型为ac时，即当所述基因型组合为ct-aa-gt-ac时，杨树样品木材的纤维长度最短。

本发明中，所述杨树样品优选的为毛白杨；所述杨树样品基因组dna优选的提取于杨树样品的功能叶。本发明对所述样品基因组dna的提取方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物基因组提取方法即可。在本发明具体实施过程中，优选的采用植物基因组dna提取试剂盒。在本发明中所述编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基这4个snp位点；是基于全基因组关联分析的策略，以毛白杨种质资源群体为依托，利用tasselv5.0软件中的混合线性模型，在全基因组水平检测与该毛白杨自然群体纤维长度性状显著关联的snp位点。本发明获得所述4个snp位点与杨树维自然群体纤维长度性状关联的显著性p≤1e-07。本发明中，所述编码lncrnalnc-033373的基因的核苷酸序列如seqidno：13所示；所述编码lncrnalnc-228084的基因的核苷酸序列如seqidno：14所示；所述pto-po46基因的核苷酸序列如seqidno：15所示；所述pto-comt24基因的核苷酸序列如seqidno：16所示。

具体序列如下(其中加粗的位点为snp位点)：

>lncrnalnc-033373

gcagtgtttatcgccacaaagtttgttgatctcgcgatgattttgttcaatttcttctcctgctttctgtgtccttccatttattgagagacatgatagaggaaagatatacgagagaggctgttatggagaagaaaaggatccactgagagggtcttgctcttgcaccaacaatgatgagttggtagcgattcagagcagagttcgaatgttgttgccgtagtggccttctcttgcatcaagggcaatatggcaaggttttggcatgtgagtttcgttttttgctgctcaagc

>lncrnalnc-228084

ctggttatcaccagaagctacggtgtctatggcaagctttaataaaaagggacccagatccgggttatcaagagacgactcatgggtgcgtagttcttgcagtgtcttgttaggaggtttgatttttggtttggcgaaggagggtgatggggttcgttttagtagcggagatggagtttcatagccgtttttatggatgcaattgtcgttttgaggaaaggaaacatgttgtggtgtggcatttggtgtggtttttgcagagactaggcccaacatagttacaaaaaaaaaccagcaatccacaatacagattagtttctacggttcaaaggagagctgaaactgaaagcggctatgttttgattcacattgcatggttttggataaatagagtggaaaaattaatgggtttctcttttctggcacaaagggcttaattattaatggtggtggcttggaagagacttctaatgatgaagcagtt

>pto-po46

cacaaactatcaactatactatagtgcctgaaagataaaaaatataaaatgtcccctctccttgcagcctttctcttgctcgtatccatgggcttgacctccgcctctaccgtgccgctccggcctggcttttacgccgagacgtgcccggaagctgatttcatagtcaaggatgtgatgaggaggaacatgattagagaaccaagaagtgctgcctcagtcatgcgttttcaattccatgattgttttgttaatgtaaactttattatataaaccaaaaacttaatacaagttttcatgacaatcttgcattattattagtattattgttattattatcaagatattaattcatttttctttgatgggttttcttttttccttgcagggttgtgatgcttctgtgctgcttgatgacacaccaaacatgctaggagagaagcttgctctgtccaacatagattctttaaggtcttatgaagttattgatgaagttaaggaagagttagagaaggtttgtccacggacggtttcttgtgcagatataattatcatggcctctagagctgctgttgtcctggtaataaatttgctcctgttatgcaagacttctgcgtttttttgctataattcttcacagaacaaaattataaccctagtgtaccctaaaagtcactagcaacttggccataagaagactggggtcttgtgttggctagccacctgcgcactaggcctatctcaccggatattctgcgaaatgggtcctttttgtccaacttttgtcctctactgttcatacaatatgaacagaacgacggtgtaattatggtctttacaaaaggtcgttttttgcccttttttcttgattcatttcggtggtgactatcgaggattgtacttgaatttgaggcctaccctctccccttcttagtagagtaatactatatccaacattctgctaacgttaaacatctggtcacaaacattgcatgtgtgggcgtggccctttaatctagtcttcttgtgaaaattatagaggggcaataattgtagctttttgaagctcgcagtttgacaataattgtatcctagaccatccctttgaatcccgtactgcgtctccttcactgttcaacatggaaatcttgcagtttaaggtttagctgataccagcatttttccagatatgccggtatctaggctttcccggatgctggaattatagacatcctctcaacacaatctcattgtttttaagtaataaagagaaaagtctcagaagattagacaagacttggtcagacagaactctttactaaagaactgatttttagcctctcttttttttgaaattttttgttctattcattgtattggattagagtggaggaccagattgggacgtgaagttagggagagtagacagcttaacagctagccaggaggactccaacaatatcatgccaagtcctagagctaatgcaagccttctcatggacctcttcgaaagattcaacctctctgtccaggatatggtagccctctcagggtcacattctattggccaagctcggtgcttctccataatgttcaggctctataaccagtcaggctccggcagaccggacccagcaattgagacaaagtacagagagaagctagacaagctttgtccacttggtggagatgaaaatgtaactggagaccttgatgcaacaccagcaacatttgataacagatacttcaaagacttggttgctgggagagggtttctaaattctgatcagacactttacacattccctgaaacgaggaaatacgtaaccctttttagcaaaaatcaacaggcatttttcagggcctttgtcgagggcatgataaagatgggcgacctgcagtctgggaggcctggagagatcagaagcaattgtaggatggccaacagccggcctgttcgtgtgctcatggagtctcaagtgagagattaggcttaaaatacaaatataataagattaaatataatttatatagtgggaaattaatgtgtcttatgggataatgttaaagtggtgatcaaatttgcaagtagggttgctgattgctgtcaattttatccttaatgcgga

>pto-comt24

atggcagagagaatgggatcattagacgaagagaaattactgagaggccaagtagaagtatggcagctcatgtttggcttcgcagaatctatggcattgaagtgtgcgatagagctaggcataccagacatcataaattctcttggtggtccagtcactttgaaccagatagcttcaggttctctacaatttccacccgttttttccatacccagaataattctatatagtcgtccatctcattttatttatttatttattttgtggggggggggggggggggggggggaggggggagggggaagggggggtgttcaggaatagactcaccttgtgttgacattccctaccttgctcgaatcatgagatttctggtccgcaaacgagtcttcacacaacacaatccatctgatggaggagagactctctatggtctaaccgacagttcaaaatggctattacgtgactcggaggtaagccttgctccaatggttctgatgcaaaactatccatggcaactagcaccatggcattacctcagccaatgtgtcaaagaaggaggcacagctttcaagaaagctcatggttgtgaaatttgggacttggcctcccaaaatccaggaattcaacaggattttcaatgatgccttggcatgtactgcaaagatcattatgagggcagttgtatcccattataaagttggttttgatgatgttgagacgttggtggatgttggaggtggtacaggaggaaatttagctgagattgtcaaagcctatcctcacatcaaaggcataaactttgatttaccacacgttgtggccgcagcaccagcatataatggggtgtcacatgttggaggcaatttttttgaggccatacctaatgctgattcaatttttatgaaggtaattaagtgtccctttattgcaatttccatgttgttgtcttgtctaacatcttttttcttgtttcttctcttaattcagtgggtattgcatgattggggagatgaatattgtgtaaagatattaaaaaactgtcggaaagcaatgcctgagaagacaggaaagctgattttagtggagattgttctgcaaccagaaggaaatggccaatttggtgatatgggaatggtgtctgatctagtgatgtttgcacacagcacaggtggaaaagagaggactgaacttgaatggaagaaattattagaggaaggagggtttcctcgctacaaaatcatcaatattcctgctttaccatcaattattgaggcctatctacagtaatacaaatttgatttctatggtcatatgttgtactaaaataaacttcaaggtcggtgctttcagaaaatttggcgagtgatatgtgcttaatggccacaaaaatttcacatggccaaagctgaattgtttttttccccccttcatggtatgtttctttgctgttgttggtggcatagttattagatagactggttcc

本发明对所述杨树样品基因组dna中编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基的测定方法没有特殊限定，采用本领域常规的snp位点基因型检测方法即可。在本发明具体实施过程中，优选的采用pcr扩增的方法实现。

本发明在确定杨树中上述4个位点的基因型组合后，根据上述4各位点的基因型组合判断杨树样品纤维的长短；当所述基因型组合为ct-ag-gt-aa时，杨树样品木材的纤维长度最长，当所述基因型组合为ct-aa-gt-ac时，杨树样品木材的纤维长度最短。当所述基因型组合其它类型，比如tt-ag-gt-aa，杨树样品木材的纤维长度大于基因型组合为ct-aa-gt-ac的杨树样品纤维长度，小于基因型组合为ct-ag-gt-aa的杨树样品纤维长度。

本发明提供了基于所述方法检测杨树纤维长短的引物组，包括：

测定编码lncrnalnc-033373的基因内的第189位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：1～3所示；

测定编码lncrnalnc-228084的基因内的第346位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：4～6所示；

测定pto-po46基因内的第171位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：7～9所示；

测定pto-comt24基因内的第613位碱基基因型的引物组，序列如seqidno：10～12所示。

具体序列如表1所示。对于上述4个snp位点中每一位点基因型的鉴定，需要用到三条引物序列，一条为f引物，两条r引物，两条r引物的区别在于最后一个位点的碱基差异。两条r引物分别与f引物组成引物对，对基因组dna进行pcr扩增。

表1鉴定四个预定位点所用引物组

本发明还提供了基于所述方法检测杨树纤维长短的试剂盒，包括所述引物组。优选的，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液，dntp，mgcl2，dna聚合酶和双蒸水。本发明对所述试剂盒中cr反应缓冲液，dntp，mgcl2，dna聚合酶和双蒸水的浓度和量没有特殊限定；所述pcr反应缓冲液优选为10×的pcr反应缓冲液。本发明中，所述dntp的使用浓度优选为20～30μmol/l，更优选为25μmol/l；所述mgcl2的使用浓度优选为20～30mmol/μl，更优选为25mmol/μl；所述dna聚合酶优选为taqdna聚合酶，所述taqdna聚合酶的使用浓度优选为2～3u/μl，更优选为2.5u/μl。本发明中所述试剂盒中的引物的使用浓度优选为5～15μmol/l，更优选为10μmol/l。

本发明中所述试剂盒的使用方法，包括以所述杨树样品基因组dna为模版，以所述引物组为引物进行pcr扩增。所述杨树样品基因组dna的浓度优选为4～6ng/μl，更优选为5ng/μl。所述pcr扩增的体系以25μl计，优选的包括：

pcr反应缓冲液：2.5μl；

mgcl2：1.8μl；

f引物：0.8μl；

r引物：0.8μl；

dntp：0.6μl；

dna聚合酶：0.3μl；

基因组dna：4.0μl；

双蒸水：14.2μl。

所述pcr扩增程序优选的如下：

步骤一：94℃：5min；步骤二：94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；步骤二进行40个循环；步骤三：72℃，10min。

本发明中，所述pcr扩增结束后，优选的采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的方法没有特殊限定，采用本领域常规的琼脂糖凝胶电泳的方法即可。对于结果的判定：以lnc-033373内的第189位为例，采用seqidno：2(简称引物2)与seqidno：3(简称引物3)所示引物分别与seqidno：1所述引物(简称引物1)组成引物对进行扩增。若引物1和2的扩增产物中出现目的条带，引物1和3的扩增产物中也出现目的条带，则可判断出此snp位点的基因型为ct；若引物1和2的扩增产物中出现目的条带，引物1和3的扩增产物中未出现目的条带，则可判断出snp位点的基因型为cc；若引物1和2的扩增产物中未出现目的条带，引物1和3的扩增产物中出现目的条带，则可判断出snp位点的基因型为tt。

本发明还提供了所述的方法在杨树分子育种中的应用。

本发明还提供了所述的引物组在杨树分子育种中的应用。

本发明还提供了所述的试剂盒在杨树分子育种中的应用。

本发明中所述方法、引物组和试剂盒能够快速准确的确定待测杨树样品的纤维长度性状，能够准确地评价杨树木材纤维形态，在杨树生长的早期高效、准确地筛选木材品质良好的用材树种，缩短杨树材性育种周期。具体的在所述应用过程中，通过检测杨树样品上述4个位点的基因型，根据育种需求，可以筛选基因型组合为ct-ag-gt-aa或者基因型组合为ct-aa-gt-ac的杨树样品进行下一步育种操作。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

使用本发明的一种基于多位点联合评价杨树木材纤维形态的方法与试剂盒，对毛白杨自然群体中随机选取的30株个体的纤维长度指标进行评价。

步骤s1：提取候选毛白杨个体基因组dna。其主要步骤如下：

步骤s11：从种植于山东省冠县的毛白杨种质资源库中随机选取20株个体，采集其功能叶(枝条上端第3～5片成熟叶)，采集完后立即放入液氮环境(-196℃)中保存；

步骤s12：利用dneasyplantminikit(qiagenchina,shanghai,china)试剂盒对叶片样品的基因组dna进行提取。

步骤s2：测定候选毛白杨个体编码lnc-033373的基因内的第189位碱基，编码lnc-228084的基因内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基的基因型。利用表1中所示的12条引物，以步骤s12获得的基因组dna为模板进行pcr扩增。

扩增程序：

步骤一：94℃：5min；

步骤二(40循环)：94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；

步骤三：72℃，10min；

之后进行4℃保存。

扩增体系：

反应总体系：25μl，主要包括：

pcr缓冲溶液(10x)：2.5μl

mgcl2(25mm/μl)：1.8μl

f引物(10μm)：0.8μl

r引物(10μm)：0.8μl

dntp(25μm)：0.6μl

taq酶(2.5u/μl)：0.3μl

dna(5ng/μl)：4.0μl

双蒸水：14.2μl。

对预定位点的基因型进行测定，并对样品的纤维长度性状进行测定，纤维长度测定方法如下：首先，利用生长锥，在候选毛白杨个体的胸径部位取一条完整的圆条状木芯；之后，将待测样品用1:1的冰醋酸和双氧水的混合溶液水浴加热离析，至木材软化为白色，弃去离析液，并用蒸馏水清洗3-5次；最后，将离析后的待测样品溶于蒸馏水，将分散的单根纤维用染色剂番红染色后制成待检玻片，采用colorclosed-circuittelevision(cctv)成像系统(panasonicsdii)对纤维素长度进行测定。测定结果如表2所示。

根据以上评价指标，结合实际样品的检测数据，发现当编码lnc-033373内的第189位碱基，编码lnc-228084内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基的基因型为ct-ag-gt-aa组合时，候选杨树个体的纤维形态表现为纤维长度较长，体现在候选个体纤维长度(1.2962mm±0.0404mm)与整体平均纤维长度(1.1862mm±0.1121mm)相比高9.30％；当编码lnc-033373内的第189位碱基，编码lnc-228084内的第346位碱基，pto-po46基因内的第171位碱基和pto-comt24基因内的第613位碱基的基因型为ct-aa-gt-ac组合时，候选杨树个体的纤维形态表现为纤维长度较短，体现候选个体纤维长度(1.0398mm±0.0782mm)与整体平均纤维长度(1.1862mm±0.1121mm)相比低12.06％。包含有其它他类型基因型组合的个体，其纤维形态表现为纤维长度适中(1.1827mm±0.0075mm)。

表2待测毛白杨个体四个预定位点的基因型及木材纤维长度

由上述实施例可知，本发明所述方法、引物组和试剂盒能够快速准确的确定待测杨树样品的纤维长度性状，能够准确地评价杨树木材纤维形态，在杨树生长的早期高效、准确地筛选木材品质良好的用材树种，缩短杨树材性育种周期。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京林业大学

<120>一种基于多位点联合评价杨树木材纤维长短的方法、引物组、试剂盒及其应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caccaacaatgatgagttggtagt24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>23

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>7

<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

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<210>12

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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<210>13

<211>294

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gcagtgtttatcgccacaaagtttgttgatctcgcgatgattttgttcaatttcttctcc60

tgctttctgtgtccttccatttattgagagacatgatagaggaaagatatacgagagagg120

ctgttatggagaagaaaaggatccactgagagggtcttgctcttgcaccaacaatgatga180

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<211>484

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ctggttatcaccagaagctacggtgtctatggcaagctttaataaaaagggacccagatc60

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