杨树CesAs基因内与木材品质性状显著关联的功能SSR标记、其应用及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种杨树CesAs基因内与木材品质性状显著关联的功能SSR标记、其应用及试剂盒。其中，该功能SSR标记包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于杨树CesA7-A外显子3区域，为(TGA)n；7B-SSR1位于CesA7-B内含子4区域，为(TTAA)m。本发明确定的这些功能标记位点为早期筛选优异种质，缩短林木育种周期提供了新的技术手段，同时也为改良木材品质性状的分子研究提供遗传学证据，对于提高我国林木遗传育种工程的发展，以及当前林木育种战略实施具有重要的意义。
【专利说明】杨树CesAs基因内与木材品质性状显著关联的功能SSR标 记、其应用及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子育种领域，具体而言，涉及一种杨树CesAs基因内与木材品 质性状显著关联的功能SSR标记、其应用及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 杨树生长迅速、轮伐期短、种间杂交与无性繁殖比较容易和便于遗传操作，在 北半球被认为是最具前途的纤维质能源树种（Li et al. ,2008，The Plant Journal, 54:569-581)。特别是随着我国经济的迅猛发展，当前的林木产量及质量已远不能满足工业 的需求，因此选育优良用材新种质，发展优良工业用材人工林，提高林地单位面积产量是解 决该问题的重要应对策略.然而，传统的以表型性状标准或杂交常规育种选择方式进行优 良种质选育，具有育种周期长、稳定性差、片面注重生长性状而忽略木材品质性状、无法消 除环境效应影响等缺点，严重限制了林木的遗传改良进程，因此，深入研究木材生物合成途 径，阐明木材纤维性状形成的分子机制是加速木材品质遗传改良的基础。
[0003] 在常见的分子标记技术中，简单序列重复（Simple Sequence Repeats, SSRs)也称 微卫星DNA，由于具有多态性高、共显性遗传、重复性强、检测容易且结果稳定等优点，在分 子标记辅助育种研究中被认为是一种理想的分子标记类型。先前开发的SSR位点多来自基 因组的随机区域，而这些SSR多呈中性进化，与物种表型性状的形成连锁不太紧密。与此不 同，基因内的SSR由于在进化过程中，一般会受到较强烈的选择压，造成与物种的表型性状 紧密连锁（Li et al·，2004 ;Molecular Biology and Evolution，21:991-1007·)，被认为 具有功能重要性。因此，建立杨树纤维素合酶基因内功能SSR标记的鉴定技术，开发木材形 成相关候选基因内SSR位点，发掘候选基因内与重要性状显著关联的等位变异位点，并进 行基因型效应分析，可直接应用于分子标记定向辅助育种。
[0004] 开发出在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出木材品质好的单株的分子标 记是本领域技术人员一直努力的方向。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种杨树CesAs基因内与木材品质性状显著关联的功能SSR标 记、其应用及试剂盒，以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出木材品质优良的单 株。
[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种杨树CesAs基因内与木 材品质性状显著关联的功能SSR标记。该功能SSR标记包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2 位于杨树CesA7-A外显子3区域，为（TGA)n ;7B-SSR1位于CesA7-B内含子4区域，为（TTAA) m，η和m为正整数。
[0007] 进一步地，7A-SSR2 为（TGA) 3 或（TGA) 4 ;7B-SSR1 为（TTAA) 3,（TTAA) 4 或（TTAA) 5。
[0008] 根据本发明的另一个方面，提供一种筛选杨树木材品质性状的方法。该方法包括 以下步骤：SI，提取毛白杨的基因组DNA ;S2,测定毛白杨CesAs基因内的功能SSR标记，功 能SSR标记包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于杨树CesA7-A外显子3区域，为（TGA) n ; 7B-SSR1位于CesA7-B内含子4区域，为（TTAA)m ;S3,根据步骤S2的测定结果进行筛选。
[0009] 进一步地，7A-SSR2含有（TGA) 4的杨树个体木质素含量高，7B-SSR1含有（TTAA) 5 的杨树个体α-纤维素含量和综纤维素含量高。
[0010] 进一步地，7A-SSR2含有纯合基因型（TGA) V(TGA)3的杨树个体木质素含量 低，7B-SSR1含有（TTAA)V(TTAa)3或（TTAA)V(TTAa) 4的杨树个体α -纤维素含量和综纤 维素含量低。
[0011] 进一步地，步骤S2中在测定7A-SSR2用的引物为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ; 在测定7B-SSR1用的引物为SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。
[0012] 根据本发明的再一个方面,提供一种筛选杨树生长和木材品质性状的试剂盒。该 试剂盒包括碱基序列为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的引物。
[0013] 进一步地，引物的PCR扩增体系为：引物对浓度为0·3πιο1/μ 1，2·0μ 12XPCR扩增 混合液，1. 〇 μ 1基因组DNA，无菌水补至10 μ 1。
[0014] 根据本发明的再一个方面，提供一种位于杨树CesA7_A外显子3区域的（TGA)1^P 位于CesA7-B内含子4区域的（TTAA)m功能SSR标记在杨树分子标记辅助选择育种中的应 用。
[0015] 本发明采用连锁-连锁不平衡（Linkage-Linkage disequilibrium)作图策略在 杨树纤维素合酶基因（CesAs)内确定了与木材品质性状(木质素含量、α-纤维素含量、综 纤维素含量）显著关联的功能SSR标记（7A-SSR2和7B-SSR1)，为研究该候选基因的功能机 制及其大规模开展林木关联作图研究提供了重要的理论研究基础。本发明确定的这些功能 标记位点为早期筛选优异种质，缩短林木育种周期提供了新的技术手段，同时也为改良木 材品质性状的分子研究提供遗传学证据，对于提高我国林木遗传育种工程的发展，以及当 前林木育种战略实施具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0017] 图1示出了 7A-SSR2标记在关联作图群体的木质素含量上的基因型效应；
[0018] 图2示出了 7A-SSR2标记在杂交作图群体的木质素含量上的基因型效应；
[0019] 图3示出了 7B-SSR1标记在关联作图群体的综纤维素含量上的基因型效应；
[0020] 图4示出了 7B-SSR1标记在杂交作图群体的综纤维素含量上的基因型效应；
[0021] 图5示出了 7B-SSR1标记在关联作图群体的α -纤维素含量上的基因型效应；以 及
[0022] 图6示出了 7B-SSR1标记在杂交作图群体的α -纤维素含量上的基因型效应。
【具体实施方式】
[0023] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0024] 鉴于树木高度杂合、周期长、异交体系等特点，在作物遗传学研究中开发的一些方 法难以在林木中实施，因此，目前在林木分子遗传学方面的主要进展是通过分子标记辅助 选择策略将影响木材纤维性状的多个基因剖分开来，可以像研究质量性状基因位点一样， 对这些数量性状基因位点进行研究，研究这些基因在染色体上的位置，并寻找与其紧密连 锁的分子标记，以此来对林木进行遗传改良。其主要应用方法为基于家系群体遗传连锁图 谱的数量性状定位，及其基于自然群体的连锁不平衡作图方法。但家系连锁作图的QTL分 析虽然可以确定功能区域位置，但分辨率较低，群体遗传信息仅限于父母本的分离组合。相 比而言，基于关联群体的连锁不平衡作图涵盖了该物种所有历史进化事件，在等位位点变 异方面具有较高的分辨率，但群体结构、样本群体规模等因素易造成关联结果的假阳性。
[0025] 本发明针对传统以表型性状标准或杂交常规育种选择方式进行优良种质选育周 期长、稳定性差、片面注重生长性状而忽略木材品质性状、无法消除环境效应影响等缺点， 组合利用连锁-连锁不平衡（Linkage-Linkage disequilibrium)作图策略，确定与重要木 材品质性状显著关联的功能变异位点，首次系统的对杨树纤维素合酶基因家族（CesAs)内 的SSR标记进行了与生长及其木材品质性状的关联分析，最终确定了与木材品质性状(木 质素含量、α -纤维素含量、综纤维素含量)显著连锁的功能SSR标记（7A-SSR2和7B-SSR1 )， 为改良木材纤维质的数量及其质量以及优良种质资源的早期选择提供了科学理论依据及 1?效技术体系。
[0026] 分别包含功能SSR标记7A-SSR2和7B-SSR1的CesA7-A及CesA7-B基因属于与杨 树木材形成中纤维素合成直接相关的纤维素合酶基因家族成员，上述序列分别命名为SEQ ID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6。
[0027] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种杨树CesAs基因内与木材品质性状 显著关联的功能SSR标记。该功能SSR标记包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于杨树 CesA7-A外显子3区域，为（TGA)n;7B-SSRl位于CesA7-B内含子4区域，为（TTAA) 111,!!和m 为正整数。应用本发明确定的这些功能标记位点为早期筛选优异种质，缩短林木育种周期 提供了新的技术手段，同时也为改良木材品质性状的分子研究提供遗传学证据，对于提高 我国林木遗传育种工程的发展，以及当前林木育种战略实施具有重要的意义。
[0028] 其中，7A-SSR2 为（TGA) 3 或（TGA) 4 ;7B-SSR1 为（TTAA) 3,（TTAA) 4 或（TTAA) 5。
[0029] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选杨树木材品质性状的方法。该方 法包括以下步骤：S1，提取毛白杨的基因组DNA ;S2，测定毛白杨CesAs基因内的功能SSR标 记，功能SSR标记包括7A-SSR2和7B-SSR1，7A-SSR2位于杨树CesA7-A外显子3区域，为 (TGA) n ; 7B-SSR1位于CesA7-B内含子4区域，为（TTAA)m ;S3,根据步骤S2的测定结果进 行筛选。应用本发明确定的这些功能标记位点为早期筛选优异种质，能够缩短林木育种周 期。
[0030] 本发明的发明人发现，当7A-SSR2含有（TGA) 4的杨树个体木质素含量高，7B-SSR1 含有（TTAA)5的杨树个体α -纤维素含量和综纤维素含量高。当7A-SSR2含有纯合基因 型（TGA)V(TGA)3的杨树个体木质素含量低，7B-SSR1含有（TTAA)V(TTAa) 3或（TTAA)3/ (TTAA)4的杨树个体α -纤维素含量和综纤维素含量低。
[0031] 优选地，步骤S2中在测定7A-SSR2用的引物为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ;在 测定7B-SSR1用的引物为SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4,引物的具体信息见表1。
[0032] 表 I
[0033]
【权利要求】
1. 一种杨树CesAs基因内与木材品质性状显著关联的功能SSR标记，其特征在于，所述 功能SSR标记包括7A-SSR2和7B-SSR1，所述7A-SSR2位于杨树CesA7-A外显子3区域，为 (TGA) n ;所述7B-SSR1位于CesA7-B内含子4区域，为（TTAA)m，η和m为正整数。
2. 根据权利要求1所述的功能SSR标记，其特征在于，所述7A-SSR2为（TGA)3* (TGA) 4 ;所述 7B-SSR1 为（TTAA)3,（TTAA)4 或（TTAA)5。
3. -种筛选杨树木材品质性状的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1，提取毛白杨的基因组DNA ; S2，测定毛白杨CesAs基因内的功能SSR标记，所述功能SSR标记包括7A-SSR2和 7B-SSR1，所述7A-SSR2位于杨树CesA7-A外显子3区域，为（TGA)n ;所述7B-SSR1位于 CesA7-B内含子4区域，为（TTAA)m，η和m为正整数； S3,根据所述步骤S2的测定结果进行筛选。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述7A-SSR2含有（TGA)4的杨树个体木 质素含量高，所述7B-SSR1含有（TTAA)5的杨树个体α -纤维素含量和综纤维素含量高。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述7A-SSR2含有纯合基因型（TGA)3/ (TGA) 3的杨树个体木质素含量低，所述7B-SSR1含有（TTAA) V(TTAA)3或（TTAA) V(TTAA)4 的杨树个体α-纤维素含量和综纤维素含量低。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中在测定7A-SSR2用的引物 为SEQIDN(λl和SEQIDN(λ2;在测定7B-SSRl用的引物为SEQIDN(λ3和SEQIDN0·4。
7. -种筛选杨树生长和木材品质性状的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增权利要求 1所述的功能SSR标记的碱基序列为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的引物。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的PCR扩增体系为：引物对浓 度为0. 3πιο1/μ 1，2. Ομ 12XPCR扩增混合液，Ι.Ομ 1基因组DNA，无菌水补至10μ 1。
9. 位于杨树CesA7-A外显子3区域的（TGA)n和位于CesA7-B内含子4区域的（^心^功 能SSR标记在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104293774SQ201310298732
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 杜庆章, 徐煲铧 申请人:北京林业大学