检测植物花器官特异性dna甲基化修饰位点的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒。其中，包括以下步骤：S1，提取植物花器官基因组DNA；S2，对植物花器官基因组DNA进行酶切；S3，分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，S7，回收、克隆S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序。采用本发明提供的接头、预扩增引物和筛选引物，能够稳定、高效地检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点。
【专利说明】检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体而言，涉及一种检测植物花器官特异性DNA 甲基化修饰位点的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化在植物发育过程以及基因组防御环境因子胁迫等方面扮演重要的作用 (Leijak-Levanic et al. 2004; Ruiz-Garcia et al. 2005; Teyssier et al. 2008; Verhoeven et al. 2010)。在植物中，DNA甲基化通常发生在CpG或者CpNpG序列上，并且在DNA修复 的循环中可以维持不变(Wassenegger2000)。所有的植物发育过程都建立在精准的时空特 异表达和基因表达调控的基础之上。越来越多的证据表明基因表达的时空特异性不仅由特 异的DNA序列(顺式以及反式作用元件控制)调控，还由一些表观修饰因子，其中最主要的就 是DNA甲基化（Chan et al. 2005)进行调控。
[0003] 目前，对基因组甲基化进行研究最常用的技术是甲基敏感扩增多态性技术 (Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，该方法是利用识别 CpG 或者 CpNpG的两种DNA甲基化敏感酶（Hpa II和Msp I )，对全基因组的DNA甲基化修饰位点进 行识别，再利用PCR对酶切片段进行扩增，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳显示DNA甲基化修饰差 异片段。MSAP技术可以对全基因组DNA甲基化修饰位点进行检测，具有高效、省时、准确以 及不依赖基因组已知信息的优点。因此，该方法得到广泛应用并迅速发展，在生命科学领域 具有广泛的应用价值。
[0004] 由于MSAP技术需要利用两种DNA甲基化敏感酶进行酶切反应，因此为得到在植物 不同组织通用的反应体系，需要针对酶、DNA模板、反应时间以及温度进行优化。但是传统 的MSAP方法只能获得DNA甲基化差异位点，无法获得该位点的核苷酸序列，不利于后续研 究的开展。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂 盒，以解决传统的MSAP方法在植物花器官中应用效果差以及无法获得差异位点的核苷酸 序列的技术问题。
[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测植物花器官特异性 DNA甲基化修饰位点的方法。该方法采用MSAP技术检测DNA甲基化，包括以下步骤：S1，提 取植物花器官基因组DNA ;S2,分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对植物花器官基 因组DNA进行酶切；S3,分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；S4,以接头为模板设 计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5,将PCR预扩增产物稀释后，加入 带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6,电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条 带，S7,回收、克隆S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序，其中，接头包括EcoRI接头 和 Hpall/MspI 接头，EcoRI 接头的序列为 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2, Hpall/MspI 接头 的序列为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和Hpall/MspI 预扩增引物，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO :5, Hpall/MspI预扩增引物的序列为 SEQ ID NO :6 ;筛选引物包括EcoRI筛选引物和Hpall/MspI筛选引物，EcoRI筛选引物序列 为 SEQ ID NO :7 ?16, Hpall/MspI 筛选引物序列为 SEQ ID NO :17 ?27。
[0007] 进一步地，S2中的酶切体系为20 μ 1酶切体系，包括IOX扩增缓冲液2. O μ 1， DNA4. 0 μ 1，EcoRI/HpaII3U/3. 2U 或 EcoRI/MspI3U/4U，EcoRI 接头 0· 5 μ 1，Hpall/MspI 接 头 0· 5 μ 1，T4 连接酶 0· 5 μ 1，(IdH2OlL 85 μ 1。
[0008] 进一步地，S4中的预扩增体系为25 μ 1体系，包括稀释100倍的酶切产物2. 5 μ 1， 浓度为10 μ mol/L的预扩增引物19. 5 μ 1，IOX扩增缓冲液2. 5 μ 1。
[0009] 进一步地，S4中的预扩增程序为94°C变性2min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C 延伸80s，30个循环，最后72°C延伸5min。
[0010] 进一步地，S5中的选择扩增体系为20 μ 1扩增体系，包括PCR扩增混合液10 μ 1， 稀释 100 倍的 PCR 预扩增产物 3 μ 1，Hpall/MspI 引物 1 μ 1，EcoRI 引物 1 μ 1，ddH205 μ 1， 其中，PCR扩增混合液包括ddH20155. 0 μ 1，IOX扩增缓冲液40. 0 μ 1，5U Taq DNA聚合酶 5 μ 1 〇
[0011] 进一步地，S5中的选择扩增程序为94°C变性5min，94°C变性30s，65°C且每个循环 退火温度降〇. 7°C退火30s，72°C延伸lmin，13个循环后；94°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸80s，23个循环，72°C延伸5min。
[0012] 进一步地，筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO : 9+SEQ ID N0：22,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ： 24, SEQ ID N0：12+SEQ ID N0：17,SEQ ID NO： 12+SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：26, SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO ：15+SEQ ID N0：17,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ： 19,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ： 17,SEQ ID NO ：16+SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：2USEQ ID N0：16+SEQ ID N0：23,SEQ ID NO ：16+SEQ ID N0：24,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：26〇
[0013] 进一步地，S6包括：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0014] 根据本发明的另一个方面，提供一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点 的试剂盒。该试剂盒包括MSAP技术所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列，其中，接头 包括EcoRI接头和Hpall/MspI接头，EcoRI接头的序列为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2， Hpall/MspI接头的序列为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;预扩增引物包括EcoRI预扩增引 物和Hpall/MspI预扩增引物，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO :5，HpaII/MspI预扩增 引物的序列为SEQ ID NO :6 ;筛选引物包括EcoRI筛选引物和Hpall/MspI筛选引物，EcoRI 筛选引物序列为SEQ ID NO :7?16, Hpall/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO :17?27。
[0015] 进一步地，筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO : 9+SEQ ID N0：22,SEQ ID NO ： 9+SEQ ID NO ： 24, SEQ ID N0：12+SEQ ID N0：17,SEQ ID NO： 12+SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ： 12+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ： 12+SEQ ID NO ：26, SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO：15+SEQ ID NO ：17,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO：19,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：17,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ： 19,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO：16+SEQ ID NO：23,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO：24,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：26〇
[0016] 采用本发明提供的接头、预扩增引物和筛选引物，能够稳定、高效地检测植物花器 官特异性DNA甲基化修饰位点；另外，采用本发明的技术方案，还实现了植物花器官特异性 的DNA甲基化位点筛选以及候选基因获得，为后续的基因表达调控分析以及表观遗传标记 开发提供了技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0018] 图1示出了本发明实施例1中利用聚丙烯酰胺凝胶电泳显示DNA差异部分修饰 位点的示意图，其中，H、M分别代表Η/E以及Μ/E引物组合的引物对，箭头指示DNA甲基化 差异位点，A-G表示不同引物组合依次为（A:H/M-3+EcoR I-5、B:H/M-3+Eco R I-6、C:H/ M-3+EcoR I-8、D:H/M-6+EcoR I-l、E:H/M-6+EcoR I-2、F:H/M-6+EcoR I-7、G:H/M-6+EcoR 1-10)，f表示雌性花器官，4表示雄性花器官；以及在附图E引物组合的黑色方框显示该位 点雌花相对雄花具有全甲基化修饰，而G引物组合的黑色方框中的数据代表雄花相对雌花 具有全甲基化修饰。
[0019] 图2示出了通过H/M-6+EcoR 1-2引物组合筛选出的差异DNA甲基化位点，经回收 克隆得到的DNA差异位点核甘酸序列，在杨树JGI数据库比对后显示出其在基因中的位置， 红色代表通过双酶切得到的差异条带，黄色代表甲基化修饰的CCGG位点，绿色代表5'UTR， 粉色代表3' UTR，蓝色代表基因的外显子，无色部分代表内含子。该图显示一个CCGG位点 上的甲基化修饰位于该基因的第一外显子上。
【具体实施方式】
[0020] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0021] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修 饰位点的方法。该方法是采用MSAP技术检测DNA甲基化，包括以下步骤：S1，提取植物花器 官基因组DNA ;S2,分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对植物花器官基因组DNA进 行酶切；S3,分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；S4,以接头为模板设计的预扩增 引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱 基的筛选引物进行PCR扩增；S6,电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，S7,回收、 克隆S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序，其中，其中，EcoRI接头的序列为SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2, Hpall/MspI 接头的序列为 SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4, EcoRI 预 扩增引物的序列为SEQ ID NO :5, Hpall/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO :6, HpaII/ MspI筛选引物序列为SEQ ID NO :7?16, EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO : 17?27,如 表1中所示。
[0022] 表 I
[0023]
【权利要求】
1. 一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法，其特征在于，采用MSAP技 术检测DNA甲基化，包括以下步骤： S1，提取植物花器官基因组DNA ; 52, 分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对所述植物花器官基因组DNA进行酶 切； 53, 分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头； 54, 以所述接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物； 55, 将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增； 56, 电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带， 57, 回收、克隆所述S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序， 所述接头包括EcoRI接头和Hpall/MspI接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID N0:2,所述 Hpall/MspI 接头的序列为 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;所述预 扩增引物包括EcoRI预扩增引物和Hpall/MspI预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列 为SEQ ID N0:5,所述Hpall/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID N0:6;所述筛选引物包括 EcoRI筛选引物和Hpall/MspI筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ IDN0 :7?16,所 述Hpall/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO :17?27。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中采用的酶切体系为20 μ 1酶切 体系，包括 10Χ 扩增缓冲液2· 0μ 1，DNA4. 0μ l，EcoRI/HpaII3U/3. 2U或EcoRI/MspI3U/4U， EcoRI 接头 0· 5 μ 1，Hpall/MspI 接头 0· 5 μ 1，T4 连接酶 0· 5 μ 1，ddH2011· 85 μ 1。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的预扩增体系为25 μ 1体系，包 括稀释100倍的所述酶切产物2. 5 μ 1，浓度为10 μ mol/L的所述预扩增引物19. 5 μ 1，10Χ 扩增缓冲液2. 5 μ 1。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的预扩增程序为94°C变性 211^11，941：变性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸8〇8,30个循环，最后721：延伸51^11。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的选择扩增体系为20 μ 1扩增 体系，包括PCR扩增混合液10 μ 1，稀释100倍的所述PCR预扩增产物3 μ l，HpaII/MspI引 物1μ l，EcoRI引物1μ 1，(ΜΗ205 μ 1，其中，所述PCR扩增混合液包括ddH20155. 0 μ 1，10X 扩增缓冲液40. 0 μ 1，5U Taq DNA聚合酶5 μ 1。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的选择扩增程序为94°C变性 5min，94°C变性30s，65°C且每个循环退火温度降0. 7°C退火30s，72°C延伸lmin，13个循环 后；94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 80s，23 个循环，72°C延伸 5min。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO: 9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID NO : 12+SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :12+SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :12+SEQ ID NO :23、SEQ ID N0：12+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID N0：15+SEQ ID N0：17,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：17, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ： 24.SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：26〇
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S6包括：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测所述PCR扩增产物。
9. 一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的试剂盒，其特征在于，包括MSAP 技术所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列，其中，所述接头包括EcoRI接头和Hpall/ MspI接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2,所述Hpall/MspI接头 的序列为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;所述预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和Hpall/ MspI预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO :5,所述Hpall/MspI预扩增 引物的序列为SEQ ID NO :6 ;所述筛选引物包括EcoRI筛选引物和Hpall/MspI筛选引物， 所述EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO :7?16,所述Hpall/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO :17 ?27。
10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID N0：12+SEQ ID NO ： 17,SEQ ID N0：12+SEQ ID N0：18,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23, SEQ ID N0：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：17,SEQ ID N0：15+SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：16+SEQ ID N0：17, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ： 24,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：26〇
【文档编号】C12Q1/68GK104293890SQ201310298633
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 宋跃朋, 马开峰 申请人:北京林业大学