雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA的筛选方法，该方法包括：S101，选取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官；S102，分别从雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA，得到雌花总RNA和雄花总RNA；S103，根据提取出总RNA建立cDNA；S104，对建立的cDNA文库进行测序；S105，根据测序结果及microRNA评估标准，判断雌花和雌花cDNA文库所对应的microRNA种类及数量;以及S106，根据microRNA种类及数量，筛选出雌性花器官与雄性花器官差异表达的microRNA。本发明的方法快速高效，易于自动化，具有实用价值和广泛的应用前景。
【专利说明】雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA的筛选 方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于遗传学研究领域，该发明公开了一种筛选雌雄异株植物中雌雄花器官 差异表达的microRNA的筛选方法。
【背景技术】
[0002] DNA测序技术是现在基因组学最重要的实验技术，在整个生物学领域具有广泛的 应用。1977年Sanger发明的末端终止测序法对于基因组测序研究具有里程碑意义。Sanger 法简便快速，经过改良后成为DNA测序研究的主要方法。随着基因组科学的发展，传统的 Sanger测序方法已经不能满足科学研究的需要。为满足这些研究需求，第二代高通量测序 技术迅速发展。第二代高通量测序技术的基因原理是边合成边测序，即通过捕捉新合成的 末端标记来确定DNA序列。在Sanger测序方法的基础上，利用不同颜色的突光标记四种 dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧 光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
[0003] 由于第二代测序技术是对序列边合成边测序，利用该技术进行转录组分析时要求 样品要具有相同的基因型，否则将会产生误差。所以对于雌雄异株植物(杨树、柳树、菠菜、 大麻、银杏、铁树、樱桃等)，由于其在生长发育、生理应答以及基因表达等多方面具有显著 差异，因此很难将第二代测序技术应用到雌雄异株植物的筛选工作中。
[0004] 另外，人们还发现在雌雄异株植物中最为显著的差异是具有生长发育迥异的雌雄 花器官，而microRNA (简写为miRNA)对于植物生长发育具有重要的调节作用，因此如果能 够通过筛选雌雄花器官差异或特异表达的microRNA,就可以对杨树性别决定机制进行深入 的研究。但是由于雌雄异株植物的基因型效应的影响，雌雄花器官差异表达microRNA的工 作迄今为止还未找到合适的开展方式。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术无法筛选出雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA 的问题，本发明提供了一种雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA的筛选方法， 该方法包括：
[0006] S101，选取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官；
[0007] S102,分别从雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA，得到雌花总RNA和雄花总 RNA ；
[0008] S103,根据提取出的雌花总RNA建立雌花cDNA文库，根据提取出的雄花总RNA建 立雄花cDNA文库；
[0009] S104,分别对雌花cDNA文库和雌花cDNA文库进行测序；
[0010] S105,根据测序结果及microRNA评估标准，判断雌花cDNA文库和雌花cDNA文库 所对应的microRNA种类及数量；以及
[0011] S106,根据microRNA种类及数量，筛选出雌性花器官与雄性花器官差异表达的 microRNAo
[0012] 优选地，在步骤SlOl中，相同基因型的雌性花器官和雄性花器官是通过从雌雄异 株植物的雄全同株个体或者雌全同株个体产生的两性花器官中分离得到的。并且，更优选 地，两性花器官的分离是在超低温条件下实施的。
[0013] 优选地，本发明是通过CTAB法从雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA的。更 优选地，采用的CTAB法包括：S1021，取雌性花器官或雄性花器官加上等量的聚丙烯吡咯烷 酮，液氮研磨，收集到离心管中；S1022,将预热的CTAB提取液以及β -巯基乙醇加入所述 离心管中，混匀，65°C水浴；S1023,加入氯仿和异戊醇，混匀抽提，在4°C下离心分离，取上 清液，加入1/3至1/5体积的12M Licl，在4°C下沉淀；S1024,在4°C下继续离心分离，弃上 清液，加入缓冲液溶解沉淀，将溶解RNA后的缓冲液转移到另一离心管中；S1025,加入氯仿 和异戊醇，混匀抽提，在4°C下离心，取上清液，重复抽提多次；S1026,取所述S1025得到的 上清液，加入1/10体积的3M NaAC与2. 5倍体积的无水乙醇，混匀后，-20°C静置沉淀RNA， 在4°C下离心，弃上清液，收集沉淀物；S1027,将步骤S1026得到的沉淀物溶于RNase-free 水中，并利用DNA消化酶去除DNA，在37°C温度下水浴，加入等体积的氯仿和异戊醇，混匀后 离心分离；S1028,将步骤S1027得到的上清液分装到I. 5ml的离心管中，然后加入无水乙醇 和NaAC，混匀后，-20°C静置并沉淀，在4°C下离心分离，弃上清液，收集沉淀物，分离得到总 RNA。
[0014] 优选地，在步骤S1021中，雌性花器官或雄性花器官的用量为0. lg，在步骤S1023 中，12M Licl的加入量为上清液总体积的1/5。
[0015] 优选地，在步骤S1028之后，进一步包括步骤S1029 :以RNsae - free水为空白对 照，使用分光光度计分别测定各RNA样品的A230、A260与A280值，判定RNA样品的纯度并 计算其总量；通过凝胶电泳判断RNA样品的完整性。
[0016] 在本发明提供的筛选方法中，优选地，上述步骤S103,根据提取出的雌花(雄花） 总RNA建立雌花(胸花）cDNA文库的方法包括：S1031，纯化所述雌花总RNA或雄花总RNA ; S1032,收集小于30bp的small RNA片段，并经过T4RNA连接酶加上人工接口；S1033,将步 骤S1032处理后的RNA片段反转录成cDNA ;S1034,对所述cDNA进行PCR扩增，得到雌花 cDNA文库或雄花cDNA文库。
[0017] 在本发明提供的筛选方法中，优选地，所指雌雄异株植物为杨树。
[0018] 由上述技术方案可以看出，本发明提供的技术方案克服了雌雄异株植物基因型对 差异表达microRNA筛选的影响，可以精准的筛选在雌雄花器官之间差异表达的microRNA， 而且该方法充分利用了第二代高通量测序技术，对差异表达microRNA进行高通量的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0020] 图1示出了本发明所提供的雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA筛 选方法流程示意图；
[0021] 图2示出了采用改良前后的CTAB方法提取出去的RNA的电泳对比图；其中，A为 采用现有CTAB方法提取出的RNA的电泳图，B为采用改良后CTAB方法提取出的RNA的电 泳图；
[0022] 图3示出了毛白杨雄全同株个体和雌全同株个体产生的混合性别花器官的电镜 扫描图；
[0023] 图4示出了预测的部分非保守microRNA结构示意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合本申请的【具体实施方式】，对本申请的技术方案进行详细的说明，但如 下实施例仅是用以理解本申请，而不能限制本申请，本申请中的实施例及实施例中的特征 可以相互组合，本申请可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0025] 为了解决现有技术存在的无法筛选出雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达 的microRNA的问题，本发明针对杨树雌雄异株植物基因型效应对雌雄花器官差异表达 microRNA筛选的影响，提供了一种基于新的研究策略而形成的新的筛选方法，该方法包括 以下步骤：
[0026] S101，选取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官；
[0027] S102,分别从雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA，得到雌花总RNA和雄花总 RNA ；
[0028] S103,根据提取出的雌花总RNA建立雌花cDNA文库，根据提取出的雄花总RNA建 立雄花cDNA文库；
[0029] S104,分别对雌花cDNA文库和雌花cDNA文库进行测序；
[0030] S105,根据测序结果及microRNA评估标准，判断雌花cDNA文库和雌花cDNA文库 所对应的microRNA种类及数量；以及
[0031] S106,根据microRNA的种类及数量，筛选出雌性花器官与雄性花器官差异表达的 microRNA〇
[0032] 通过以上步骤可以看出，因为选取了具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器 官，从而避免了基因型效应对于雌雄花器官差异表达microRNA筛选的影响，为后续的高通 量筛选雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA提供了重要的技术支持。
[0033] 下面我们将结合图1根据本发明所提供的技术方案，逐步解释每一个步骤的具体 实施过程。
[0034] 关于步骤S101，其目的在于通过选取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器 官，从而避免了基因型效应对于雌雄花器官差异表达的microRNA筛选的影响。具体而言， 本发明的发明人利用雌雄异株植物的雄全同株个体或者雌全同株个体产生的两性花器官 获得了具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官，该类型的雌性花器官和雄性花器官因 为产生自同一个体，因此具有相同的基因型。由于通常雄全同株个体或者雌全同株个体非 常罕见，可用于RNA提取的样本量较少。因此，为了保证RNA不被降解，在本发明提供的 具体实施例中，对两性花器官的分离是在超低温下进行的，例如，在液氮环境（_196°C)中， 可利用枪型镊和解剖针将两性花器官分离，由于在低温下植物材料易碎，整个过程需要缓 慢仔细进行，以防止植物材料破碎。
[0035] 关于步骤S102,从雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA，得到雌花总RNA和雄花 总RNA。此步骤的目的在于得到雌花总RNA和雄花总RNA，以便分析差异化表达的mircoRNA。 在现有技术中，提取植物中总RNA的方法有很多种，本发明并不限制提取RNA的方法。在本 发明的【具体实施方式】中采用CTAB法对雄性花器官和雌性花器官进行总RNA的提取。这里 所指的CTAB法是指利用CTAB进行RNA提取的方法，CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀 核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中（>〇.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多 聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后 加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。本发明可采用传统的CTAB方法进行RNA提取，也可以 采用改良后的CTAB方法提取RNA。
[0036] 常规的CTAB方法可包括如下实施步骤：取雌性花器官或雄性花器官两克，液氮 中研磨成细粉末；加入10ml65°C预热的CTAB提取液和500 μ 1 β -巯基乙醇，剧烈涡旋匀 浆，65°C水浴温育30min ;每管加入IOml氯仿异戊醇（24 :1)，涡旋混匀，冰浴lOmin。4°C， 12000rpm离心lOmin。取上清，加入I / 3体积的8M LiCl和500μ1β-乙醇，-20°C沉 淀过夜；4 °C，12000rpm离心20min。弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入 120 μ 1 β -巯基乙醇和880 μ 12M Na Ac (pH4. 0)，混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24:1)，润旋混勻，冰浴5min。4°C，12000rpm离心10min。取上清，加入等体积酚：氯仿：异 戊醇（25 :24:1)，润旋混勻，冰浴5111；[11。41€，12000印1]1离心1〇111；[11。取上清，加入等体积氯 仿：异戊醇（24:1)，润旋混勻，冰浴5min。4°C，12000rpm离心10min。取上清，加入1 / 10 体积的31似40(?册.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-201：放置过夜。41：，14000印111。加入 100以18似86-仕66-(1(1!120溶解沉淀。取1(^1稀释200倍检测淠入230、260、280下的(? 值，检测RNA样品的纯度与浓度。
[0037] 本发明提供的改良后的CTAB法的具体流程为：S1021，取雌性花器官或雄性花器 官加上等量的聚丙烯吡咯烷酮，液氮研磨，收集到离心管中；S1022,将预热的CTAB提取液 以及β -巯基乙醇加入所述离心管中，混匀，65°C水浴；S1023,加入氯仿和异戊醇，混匀抽 提，在4°C下离心分离，取上清液，加入1/3至1/5体积的12M Licl，在4°C下沉淀；S1024,在 4°C下继续离心分离，弃上清液，加入缓冲液溶解沉淀，将溶解RNA后的缓冲液转移到另一 离心管中；S1025,加入氯仿和异戊醇，混匀抽提，在4°C下离心，取上清液，重复抽提多次； S1026,取所述S1025得到的所述上清液，加入1/10体积的3M NaAC与2. 5倍体积的无水乙 醇，混匀后，_20°C静置沉淀RNA，在4°C下离心，弃上清液，收集沉淀物；S1027,将步骤S1026 得到的所述沉淀物溶于RNase-free水中，并利用DNA消化酶去除DNA，在37°C温度下水浴， 加入等体积的氯仿和异戊醇，混匀后离心分离；S1028,将步骤S1027得到的所述上清液分 装到1.5ml的离心管中，然后加入无水乙醇和NaAC，混匀后，-20°C静置并沉淀，在4°C下离 心分离，弃上清液，收集沉淀物，分离得到总RNA。通过实施上述提取过程，就可将雌性花器 官和雄性花器官中的总RNA提取出来。这种改良的CTAB方法与传统方法相比，在抽提步骤 中，减少了等体积苯酚：氯仿：异戊醇抽提这一步骤，不但精简了试验步骤，还取得了很好 的提取效果。另外，在步骤S1023中，优选加入Licl的浓度为12M，加入量为上清液总体积 的1/5体积，与传统方法相比，改变了 LiCL的浓度和用量。通过以上步骤的改良，使得本发 明提供的CTAB方法具有所需组织量小，适用于微量组织取样，有利于提高转录分析的精准 性的优点；将采用传统CTAB方法提取出的总RAN与采用改良后CTAB法提取的总RAN的电 泳图片（如图2所示）可以看出，采用改良后CTAB方法提取得到的RNA片段完整，无拖尾现 象，说明该方法提取的精准性更好，纯度更高。
[0038] 完成上述步骤后，可进一步对得到的总RNA进行测试和计算，具体可以 RNsae-free水为空白对照，使用分光光度计分别测定各RNA样品的A230、A260与A280值， 判定RNA样品的纯度并计算其总量，然后通过凝胶电泳判断RNA样品的完整性。
[0039] 关于S103,完成总RAN的提取后，就可以根据提取出的雌花总RNA建立雌花cDNA 文库，根据提取出的雄花总RNA建立雄花cDNA文库了；根据RNA建立cDNA文库的方法已经 为常规技术方法，在本发明的【具体实施方式】中，构建cDNA文库的具体方法包括：S1031，纯 化雌花总RNA或雄花总RNA，可采用15%PAGE电泳分离的方法进行RNA的纯化工作；S1032， 收集小于30bp的small RNA片段，并经过T4RNA连接酶加上人工接头，该步骤需要加上一致 序列的人工接头，其目的在于为接下来边合成边测序过程所需要的引物提供序列信息。，因 为该人工接头方式为第二代高通量测序技术的常规技术手段，在此就不再赘述；S1033,将 步骤S1032处理后的RNA片段反转录成cDNA,具体而言可采用Super-Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)方法实施逆转录；S1034,对 cDNA 进行 PCR 扩增，就可以得到雌花cDNA文库和雄花cDNA文库了。
[0040] 关于S104,对雌花CDNA文库和雌花CDNA文库进行测序；该测序方法为常规测序 方法，【具体实施方式】为现有技术，在此将不再赘述。
[0041] 关于S105,根据测序结果及microRNA评估标准，判断雌花cDNA文库和雌花cDNA 文库所对应的microRNA种类及数量。具体而言，包括：
[0042] 第一，可根据测序reads数量估算microRNA表达量；
[0043] 第二，可根据miRNA评判标准(Meyers等，2008)对非保守miRNA进行鉴定。鉴定 具体标准如下：
[0044] UmiRNA前体序列的二级结构为典型的茎环发卡结构；
[0045] 2、茎环发卡结构中的碱基错配数兰4nt ;
[0046] 3、miRNA成熟序列中间的茎环结构不能超过2个，并且单个茎环内部碱基数不能 大于2个；
[0047] 4、miRNA*序列结构同样遵循第2,第3条标准；
[0048] 5、miRNA的环臂长度在10至IOOnt之间；
[0049] 6、整个前体长度在几十到300nt之间；
[0050] 7、miRNA成熟序列长度在20-23nt之间；
[0051] 8、自由能（MFE)小于 _20kcal/mol。
[0052] 上述非保守miRNA的评判标准具体出处为Meyers2008年论文：Criteria for annotation of plant MicroRNAs. Plant Cell, 200820(12) :3186-3190.非保守miRNA判断 可使用 Mireap 软件（http://sourceforge. net/projects/mireap/)进行筛选；
[0053] 第三，保守miRNA则是通过对上述miRNA候选序列对判别分析之后，与mirbase数 据库19. 0进行BLAST就可以筛选得到保守miRNA序列。mirbase数据库19. 0是公开数据 库，可通过WWW. mirbase. org网址免费使用。
[0054] 根据上述具体判断步骤，筛选人员就可以判断出雌花cDNA文库和雌花cDNA文库 所对应的microRNA种类及数量。
[0055] 因此，根据步骤S105结果，可实施步骤S106。即根据microRNA的种类及数量，筛 选出雌性花器官与雄性花器官差异表达的microRNA。进而根据所得差异表达的microRNA, 可进行雌雄异株中雌雄花器官差异表达分析，预测microRNA作用的靶基因以及性别特异 遗传标记开发等后续研究。
[0056] 以下将以杨树的雌雄花器官差异表达的microRNA的筛选过程为例，进一步说明 本发明所提供的筛选方法。
[0057] 实施例1
[0058] 原料的获得：毛白杨雄全同株个体（Populus tomentosa '2-14'）来源于全国毛白 杨种质资源库；
[0059] CTAB法中采用的各种试剂均为市售产品；
[0060] 采用Mireap软件系统进行microRNA评估。
[0061] 具体操作步骤如下：
[0062] 步骤S101,选择毛白杨雄全同株个体（Populus tomentosa '2-14'）产生的混合 性别的花序。图3示出了该雄全同株个体产生的混合性别的花器官的电镜扫描图。这两幅 图都是两性花器官，左边的是雄全同株，右边的是雌全同株。Pi代表Pistil (雌蕊），St代 表Staman(雄蕊），为了保证RNA不被降解，对两性花器官的分离是在液氮环境（_196°C) 中进行的，利用枪型镊和解剖针将两性花器官分离，由于在低温下植物材料易碎，整个过 程需要缓慢仔细进行，以防止植物材料破碎。
[0063] 步骤S102,利用改良的CTAB法对微量的花序样品的总RNA进行提取。具体方法 如下：
[0064] 步骤S1021，在0. Ig左右的植物组织加上等量PVPP(聚丙烯吡咯烷酮)，液氮研磨， 收集50ml离心管中；
[0065] 步骤 S1022,加入 15ml (W:V=1:5)65°C预热的 CTAB 提取液（CTAB2%，PVP4%，EDTA2 5mM, Nacl2. OmM, Tris-HCllOOmM, ρΗ8· 0)，并加入 300 μ L β -巯基乙醇，涡旋混匀，65°C水浴 IOmin;
[0066] 步骤S1023,加入等体积的氯仿：异戊醇（V :V=24:1)，轻轻混匀抽提 IOmin, 4°C 12000rpm 离心 10min。取上清液，加入 1/5 体积的 12MLicl, 4°C沉淀 2h;
[0067] 步骤S1024,在4°C 12000rpm离心20min。弃上清液，加入800 μ LSSTE缓冲液溶 解沉淀。将溶解RNA后的缓冲液转移到2ml离心管中；
[0068] 步骤S1025,加入等体积氯仿：异戊醇，轻轻混勻抽提5min，4°C 12000rpm离心 10min。取上清液，重复抽提2次；
[0069] 步骤S1026,取上清液，加入1/10体积的3M NaAC(ρΗ5· 2)与2. 5倍体积的无水乙 醇，混匀后，_20°C静置2h沉淀RNA。4°C 12000rpm离心20min，弃上清液，收集沉淀；
[0070] 步骤S1027,利用DNA消化酶去除DNA(溶于水的RNAl μ g，IOXDNase反应缓冲液 10 μ L，DNaselO μ L，RNase-free 水补至 50 μ L) 37°C水浴 30min。加入等体积的 24:1 (氯 仿：异戊醇）上下颠倒混匀后12000转10min，离心；
[0071] 步骤S1028,将上清液分装到I. 5ml的离心管中，然后加入3倍体积的无水乙醇和 1/3 体积的 10mol/L 的 NaAC，混匀后，-20°C静置 2h 沉淀 RNA。4°C 12000rpm 离心 20min,弃 上清液，收集沉淀，得到总RNA提取物。
[0072] 最后可以检测以下提取得到RNA的纯度、总量和完整性，具体而言，以RNsae-free 水为空白对照，使用分光光度计分别测定各RNA样品的A230、A260与A280值，判定RNA样 品的纯度并计算其总量。通过凝胶电泳判断RNA样品的完整性。
[0073] 然后实施步骤S103,根据提取出的雌花总RNA建立雌花cDNA文库，根据提取出的 雄花总RNA建立雄花cDNA文库。将总RNA经15%PAGE电泳分离纯化后，切割回收小于30bp 的small RNA片段，然后经过T4RNA连接酶加上人工接口，再经Super-Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)反转录成 cDNA，最后 PCR 扩增，回收 cDNA 文库。
[0074] 实施步骤S104,将cDNA文库送至上海伯豪生物技术有限公司进行测序。
[0075] 实施步骤S105,根据测序结果及microRNA评估标准，判断雌花cDNA文库和雌花 cDNA文库所对应的microRNA种类及数量。
[0076] 根据reads数估算microRNA表达量，根据植物非保守microRNA评判标准进行保 守RNA和非保守RNA的预测。具体结果如表1至表4所示：
[0077] 表1雄全同株毛白杨雌雄花器官差异表达保守miRNA
[0078]
【权利要求】
1. 一种雌雄异株植物中雌雄花器官差异表达的microRNA的筛选方法，其特征在于，所 述方法包括： S101，选取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官； S102,分别从所述雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA，得到雌花总RNA和雄花总 RNA ； S103，根据提取出的所述雌花总RNA建立雌花cDNA文库，根据提取出的所述雄花总RNA 建立雄花cDNA文库； 5104, 分别对所述雌花cDNA文库和雌花cDNA文库进行测序； 5105, 根据测序结果及microRNA评估标准，判断所述雌花cDNA文库和雌花cDNA文库 所对应的microRNA种类及数量；以及 5106, 根据microRNA种类及数量，筛选出雌性花器官与雄性花器官差异表达的 microRNA。
2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，在所述步骤S101中，所述相同基因型 的雌性花器官和雄性花器官是通过从雌雄异株植物的雄全同株个体或者雌全同株个体产 生的两性花器官中分离得到的。
3. 根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S101是在超低温条件下实 施的。
4. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S102中采用CTAB法从所述 雌性花器官和雄性花器官中提取总RNA。
5. 根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S102采用的CTAB法包括： S1021，取雌性花器官或雄性花器官加上等量的聚丙烯吡咯烷酮，液氮研磨，收集到离 心管中； 51022, 将预热的CTAB提取液以及β -巯基乙醇加入所述离心管中，混匀，65°C水浴； 51023, 加入氯仿和异戊醇，混匀抽提，在4°C下离心分离，取上清液，加入1/3至1/5体 积的12M Licl，在4°C下沉淀； 51024, 在4°C下继续离心分离，弃上清液，加入缓冲液溶解沉淀，将溶解RNA后的缓冲 液转移到另一离心管中； 51025, 加入氯仿和异戊醇，混匀抽提，在4°C下离心，取上清液，重复抽提多次； 51026, 取所述S1025得到的所述上清液，加入1/10体积的3M NaAC与2. 5倍体积的无 水乙醇，混匀后，-20°C静置沉淀RNA，在4°C下离心，弃上清液，收集沉淀物； 51027, 将步骤S1026得到的所述沉淀物溶于RNase-free水中，并利用DNA消化酶去除 DNA，在37°C温度下水浴，加入等体积的氯仿和异戊醇，混匀后离心分离； 51028, 将步骤S1027得到的所述上清液分装到1. 5ml的离心管中，然后加入无水乙醇 和NaAC，混匀后，-20°C静置并沉淀，在4°C下离心分离，弃上清液，收集沉淀物，分离得到所 述总RNA。
6. 根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1021中，所述雌性花器官 或雄性花器官的用量为0. lg，所述步骤S1023中，12M Licl的加入量为上清液总体积的1/5 体积。
7. 根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，在所述步骤S1028之后，进一步包括 步骤S1029 : 以RNsae - free水为空白对照，使用分光光度计分别测定各RNA样品的A230、A260与 A280值，判定RNA样品的纯度并计算其总量； 通过凝胶电泳判断RNA样品的完整性。
8. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S103包括： S1031，纯化所述雌花总RNA或雄花总RNA ; 51032, 收集小于30bp的small RNA片段，并经过T4RNA连接酶加上人工接口； 51033, 将所述步骤S1032处理后的RNA片段反转录成cDNA ; 51034, 对所述cDNA进行PCR扩增，得到所述雌花cDNA文库或雄花cDNA文库。
9. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述雌雄异株植物为杨树。
【文档编号】C12Q1/68GK104293889SQ201310298603
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 宋跃朋 申请人:北京林业大学