一种鉴别罗汉果性别的scar分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种用PCR鉴定罗汉果的雌雄的方法，具体提供了罗汉果雄株的特异DNA片段序列，及PCR引物的设计，PCR条件的优化等。
【专利说明】—种鉴别罗汉果性别的SCAR分子标记
【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种鉴别罗汉果性别的SCAR分子标记的分离和确定。
【背景技术】
[0002]罗汉果是一种名贵药材。中医药学认为，罗汉果甘、酸，性凉，有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效。
[0003]罗汉果为雌雄异株植物，其雌株与雄株的形态特征肉眼无法识别，只能等到开花时才能分辨雌雄。目前实际生产上应用的种苗，来源几乎都是雌株的扦插苗或者组培扩繁苗，很少使用种子繁殖的实生苗。扦插或组织培养优点是操作比较简便、见效快，但田地、人工、培养基等成本还是相对较高。而且由于现在这种大量无性繁殖的应用，使得种苗质量下降，多感染病毒及其它病害。种苗生长势弱、根系不发达、种植成活率低，成活后也多由于病毒和线虫等病虫害的发作，造成大量死苗、减产。另外过多的无性繁殖，还使得罗汉果作为我国一个稀有药用植物来说，品种愈来愈单一。相比较来说，用种子繁殖可以克服上述缺点。种子繁殖的实生苗，没有病毒病害感染，根系更加发达，植株生长健壮，产量更闻。物育种上，如果能够在幼苗期间鉴定雌雄，就可使用较多数量的实生苗作为选择的对象，其育种选优率就可大大提高，而且选择越早育种效率越高。
[0004]性别的早期识别对于实际生产中性别的调控更具意义，生产上需要大量种植雌株，但罗汉果种子中70%以上为雄株。所以生产时需要大量种植，等到开花后再把雄株人工拔去。除了占用田地外，还很费人工。对罗汉果得育种和优良品种的推广造成很大困难。如果能在幼苗阶段鉴定雌雄，可以大大减少成本。
[0005]应用本发明所用方法，可以在早期对罗汉果幼苗进行雌雄株鉴定，有针对性的进行实生苗生产，降低种苗生产等成本，提高种苗质量。是进行优质罗汉果种苗生产不可缺少的技术手段。
[0006]目前植物雌雄鉴定的方法有四种；1.通过外部形态特征鉴别；2.通过生理代谢差异鉴别；3.通过化学物质分析鉴别；4.通过RAH)标记鉴别雌雄株。雌雄异株植物在幼苗期难以从外部形态来预测性别，因此能进行性别的早期鉴定的可靠指标主要依赖于其内部遗传类型或生理生化来鉴别。
[0007]目前随机扩增多态性 DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)标记已广泛用于雌雄异株植物的性别鉴别研究中。秦新民等对罗汉果基因组DNA的RAPD分析结果表明，部分引物PCR扩增时雌雄株间具有多态性。并已用此种方法，获得了几个与雌雄相关的标记片段，表明了罗汉果可能存在性染色体，或者这些标记是与性别决定基因紧密连锁的。我们创造性地在随机引物序列中加入简并碱基，扩增得到了一个雄株特异片段。但由于RAPD标记不够稳定，本发明设计了一系列实验拟将RAPD标记转化为序列特异性扩增区(Sequence-characterized Amplified Reg1n, SCAR)标记，以便尽快应用于罗汉果早期性别的鉴定研究。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种能鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记。
[0009]本发明以罗汉果雌雄株叶片为材料，用10个随机引物进行筛选，扩增反应体系及反应程序参照陈其军等人(陈其军，韩玉珍，傅永福，等.大麻性别的RAPD和SCAR分子标记[J] ?植物生理学报，2001，27( 2): 173- 178.)的方法。其中引物P7扩增得到I条雄株特异性片段。将这条差异片段回收、克隆及测序，获得的序列长度为1216bp，将其命名为Z-1200，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010]提取罗汉果雌株和雄株的基因组DNA，根据上述Z-1200所述的核苷酸序列，设计系列引物进一步确定精确的SCAR标记。设计第一套引物Z1200-F1和Z1200-R1，所述引物序列如SEQ ID N03、4所示。结果发现，用第一套SCAR标记引物进行扩增，得到的扩增结果，在罗汉果雌株和雄株间有差异。从琼脂糖凝胶电泳分析结果可以看到:第一套SCAR标记引物Z1200-F1弓丨物与Z1200-R1，扩增罗汉果基因组DNA时，所有雄株可以扩增得到648bp的目的条带。但雌雄株都可以扩增得到一背景条带，此条带比648bp目的条带略小。
[0011]为分析背景条带与目的条带间的差异，本发明在PCR扩增后、分别回收了雌雄株所扩增得到的各条带片段，克隆到T载体进行测序，并对结果进行分析。通过DNAMAN进行序列比对，结果是上述PCR中的目的条带与背景条带相比较，大部分序列相同，只是中间部分多出了 93碱基，如SEQ ID N0:5所示。因此，此序列才是雄株特异片段，确定此段序列是用于SCAR标记的目的片段。
[0012]根据上述实验结果，设计第二套SCAR标记引物，Z1200-F2和Z1200-R2。所述引物序列如SEQ ID N05、6所示。扩增罗汉果基因组DNA时，所有雄株可以扩增得到811bp的目的条带，条带单一、大小正确、没有背景条带干扰。
[0013]为了验证第二套SCAR标记引物，在鉴定罗汉果雌雄株方面的可靠性。我们随机从田间选取了一些已经开花的样品，编号后带回实验室。用此对引物进行雌雄株的PCR鉴定。结果是，用此引物鉴定雌雄株，结果正确带单一，结果正确、实验结果稳定、可靠。
[0014]上述结果表明，雄株所特有的93bp序列，即SEQ ID NO:2为罗汉果雄株特异的SCAR分子标记。
[0015]本发明的具体技术路线如图1所示。
[0016]本发明所提供的SCAR标记对于罗汉果的批量产业化生产，具有重大意义。
[0017]下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明技术路线图。
[0019]图2是用随机引物P7分别对罗汉果雌雄株进行扩增的结果，图中从左向右依次为:1-5泳道为雌性二倍体罗汉果，6-9泳道为雄性二倍体罗汉果，10-11泳道为雌性三倍体罗汉果，12泳道为雄性三倍体罗汉果，13泳道为Marker (条带自大到小依次为:5000bp ；3000bp ；2000bp ；100bp ；750bp ；500bp ；250bp ；100bp),图中箭头所指，即为特异条带扩增目的片段，大小约为1200bp。
[0020]图3是Z1200-F1引物与Z1200-R1引物扩增罗汉果基因组DNA结果电泳图，扩增目的片段大小为648bp，图中从左向右依次为:1- 7泳道为雌性单株；8-11泳道为雄性单株；12泳道为水负对照；13泳道为Marker。
[0021]图4是Z1200-F2引物与Z1200-R2引物，扩增罗汉果基因组DNA结果琼脂糖凝胶电泳图，扩增目的片段大小为811bp，图中从左向右一次为:1- 7泳道为雌性单株；8-11泳道为雄性单株；12泳道为水负对照；13泳道为Marker。
[0022]图5为SCAR标记引物Z1200-F2和Z120-R2对田间随机样品的雌雄鉴定结果。
[0023]发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0024]本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
[0025]除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。
[0026]本发明提出了一种鉴别罗汉果雌雄株的SCAR分子标记，其特征在于所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，所述SCAR标记的5’端基因组核苷酸序列如SEQID NO: 2的第1-249位的核苷酸所示，所述SCAR标记的3’端基因组核苷酸序列如SEQ IDNO: 2的第343-1216位的核苷酸所示，SEQ ID NO: 2的第250-342位核苷酸序列为本发明所提供的SCAR分子标记。在本发明中，所述SCAR分子标记也可以称为罗汉果雄株特异性序列、或雄株特异性序列 、或雄株特异性核苷酸序列。
[0027]本发明提出了一组用于区分罗汉果雌雄株的PCR引物，其中，该一组PCR引物包含第一 PCR引物和第二 PCR引物，其中第一 PCR引物包含SEQ ID NO: 2中非SCAR标记部分的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二PCR引物来自SEQ ID N0:2中的SCAR标记部分或是SEQ ID NO: 5所示的至少11个或更多个连续多核苷酸，该一组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第一引物来自SEQ ID NO:2中SCAR分子标记的5’端核苷酸序列部分的的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二引物来自SEQ ID NO: 2中SCAR分子标记的3’端核苷酸序列部分的的至少11个或更多个连续多核苷酸，该一组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的，并且所述引物组在扩增来自罗汉果雌雄株的基因组DNA时，雄株的基因组DNA所扩出的扩增子片段比雌株基因组DNA所扩出的扩增子片段大93个bp。
[0028]根据本发明的实施例，用于区分罗汉果雌雄株的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID N0:3或4所示，或如SEQ ID N0:6或7所示。
[0029]本领域技术人员应该知晓，通过基因组测序技术，从而获得本发明所保护的SCAR分子标记的5’上游或3’下游更长的基因组核苷酸序列，并根据该核苷酸序列设计引物进行罗汉果雌雄株鉴定的方法和引物均在本发明保护范围之内。
[0030]在本文中所使用的术语“引物”是分离的多核酸，其通过核酸杂交与互补的目标多核酸链退火形成引物和目标多核酸链的杂交体，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶沿目标多核酸链延伸。本发明的引物对涉及它们用于扩增目标多核苷酸分子的扩增的用途，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。
[0031]本发明还提出了一种区分罗汉果雌雄株的PCR方法，其特征在于所述PCR方法所获得的罗汉果雄株的扩增产物包含部分或全部的如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。更具体的，所述PCR方法包括以下步骤:a)提取罗汉果幼苗的基因组DNA ；
b)设计引物，所述引物可以特异性扩增出罗汉果雄株所特有的部分或全部序列；c)进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；d)检测所述PCR扩增产物；其特征在于，所述PCR方法所用的引物组如上所述。
[0032]在本发明中，“PCR扩增产物”也可以表述为“扩增子”，术语“扩增子”的使用要特别排除可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚物。所述的“区分”指把罗汉果雌株和雄株区分开来，或是鉴定出罗汉果雌株或雄株。
[0033]本发明还提出了一种用于鉴定罗汉果雌雄株的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含有上述引物。
[0034]本发明还提出了一种用于区分罗汉果雌雄株的核苷酸探针，其特征在于，所述探针选自SEQ ID N0:5或与其互补的部分连续核苷酸序列，可以在严谨杂交条件下特异性检测出罗汉果雄株基因组中的特异SCAR分子标记。
[0035]本发明还提供了一种区分罗汉果雌雄株的方法，所述方法包括将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性鉴定出罗汉果雌株和雄株，其特征在于，所述探针选自SEQ ID N0:5或与其互补的部分连续核苷酸序列。
[0036]本发明上述所提出的罗汉果雄株特异的SCAR分子标记、罗汉果雌雄株鉴定方法、DNA引物、核苷酸探针或试剂盒等，在无毒罗汉果种苗的生产中的具有重要的应用价值。
【具体实施方式】
[0037]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《分子克隆》。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成，测序由北京华大基因研究中心完成，胶回收使用OMEGA B1-TEK公司的Gel Extract1n Kit (D2500-01)，克隆使用TIANGEN公司的pGM-T Easy,方法均参照试剂盒提供的方法进行。
[0038]实施例1.随机弓丨物P7对罗汉果不同雌雄株的RAPD标记
本发明先以罗汉果雌雄株叶片为材料，提取基因组DNA，并用10个随机引物进行扩增多态性筛选，扩增反应体系及反应程序参照陈其军等人(陈其军，韩玉珍，傅永福，等.大麻性别的RAPD和SCAR分子标记[J].植物生理学报，2001，27 ( 2): 173-178.)的方法。实验结果发现，其中一条随机引物P7扩增得到了 I条罗汉果雄株特异性片段。将这条差异片段回收、克隆及进行测序分析，获得一条长度为1216bp的核苷酸序列，将其命名为Z-1200，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0039]其中，用随机引物P7对5个二倍体雌株、4个二倍体雄株、2个三倍体雌株和I个三倍体雄株的基因组DNA进行扩增，并将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析的结果如图2所示，所有的罗汉果雄株(泳道6-9为雄性二倍体罗汉果，泳道12为雄性三倍体罗汉果)都扩增获得了一条大小约为1.2kb的雄株特有多态性片段；而所有的罗汉果雌株(1-5泳道为雌性二倍体罗汉果，10-11泳道为雌性三倍体罗汉果)都未检测到这一多态性片段，图中箭头所指，即为特异条带扩增片段。
[0040]本实施例中罗汉果基因组DNA的提取方法为CTAB法，具体方法及步骤如下:
O取一嫩叶片在液氮中研成粉末；
2)将样品放入液氮冻过的EP管中，加65°C预热2XCTAB Iml ；3)65°C水浴 Ih ；
4)加入等体积的酌.:氯仿:异戍醇(25:24:1)抽提,离心1000rpm, 1min,取上清；
5)加入等体积异丙醇，_2(TC沉淀20-30min；
6)1000rpm离心1min,倒掉上清,70%乙醇，1000rpm, 1min,倒掉上清,晾干；
7)加50ul RNase- H20 水溶解，37°C 20min 消化 RNA,放 _20°C保存备用。
[0041]以上述提取的基因组DNA作为模板，用随机引物P7按以下PCR扩增体系进行扩增，所述P7引物的核苷酸序列是5’ ANTCCNAAAT 3’(SEQ ID NO:1)，PCR扩增体系如下:
1Xbuffer 2 ul dNTP0.4ul
P7Iul
Taq0.4ul
DNA3ul
水13.2ul
20ul
PCR 扩增程序是:95°C,3min ；94°C,30sec ;32_45°C，60sec ；72°C,90sec ；30 个循环，72°C，10min，4°C 保存。
[0042]实施例2.罗汉果雌雄株特异性SCAR标记的确定
为了将RAPD标记转化为更加精确的SCAR标记，发明人依据上述罗汉果雄株特异片段Z-1200(SEQ ID NO:2)，根据其核苷酸序列在其两端设计新的引物对，以特异扩增此片段。所述Z-1200的扩增引物如下:
Z1200-F1: 5’ AGAAACTAATAATGAATTACCACTG 3’ (SEQ ID NO:3);
Z1200-R1: 5’ CAAGTTTTTGGATATAGTGGTAGTT 3’ (SEQ ID NO:4)。
[0043]以11个不同罗汉果雌雄株的基因组DNA作为模板，用引物Z1200-F1和Z1200-R1按以下PCR扩增体系进行扩增。
[0044]PCR扩增体系:
水13.2ul
1Xbuffer 2 ul dNTP0.4ul
Z1200-F1 0.5ul Z1200-R1 0.5ul Taq0.4ul
DNA3ul
PCR 扩增程序是:95°C,3min ；94°C,30sec ；58°C,20sec ；72°C 45sec ；30 个循环，72°C，10min，4°C 保存。
[0045]将上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果如图3所示，所有雄株(泳道8-11)和雌株(泳道1-7)都扩增获得了一个同样大小的片段(背景条带)，此外，雄株还扩增获得了一个大一点的雄株特异性片段(目的条带)。
[0046]为分析背景条带与目的条带间的差异，本发明分别回收了雌雄株的目的条带和背景条带，克隆到T载体上进行测序分析，结果发现:上述PCR中的雄株特异性片段(目的条带)为648bp，用DNAMAN进行序列比对，发现PCR中的648bp的目的条带与背景条带相比较，大部分序列相同，只是中间部分多出了 93个碱基，这93个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0047]为进一步确定SEQ ID NO: 5是否为罗汉果雄株的特异SCAR分子标记，本发明根据这一雄株特异序列，进一步设计引物。由于此序列较短，不适宜在其内部设计PCR扩增的引物对来单独鉴定雌雄株，因此在设计引物时，一条引物设计在此段特异序列中，另外一条引物则设计在其下游，具体引物序列如下所示:
Z1200-F2:5，GAGTTCAAACAAGGTCGGGGTGGGA 3，(SEQ ID NO:6),
Z1200-R2:5’ GCTAAATTCCACCGCTTGCTTGCTC 3’(SEQ ID NO:7)。
[0048]用上述引物对分别扩增罗汉果雌雄单株的基因组DNA时，其扩增结果与预期相符，所有雄株可以扩增得到特异片段，而雌株没有。具体结果如图4所示，所有罗汉果雌株(泳道1-7)均没有检测出扩增片段，而所有罗汉果雄株(泳道8-11)都获得了特异性的扩增片段。
[0049]上述结果上面在进行PCR扩增时，雌株由于缺少上述的93bp核苷酸序列，因此不能扩增出条带，而雄株则可以扩增得到一个Sllbp的特异性片段。
[0050]实施例3.田间随机取样的雌雄鉴定
随机选取田间已经开花的26个株系作为鉴定样品，其中样品编号为10、11、13、14、20、22、23、24、25的为雄株，其余为雌株。提取基因组DNA，用SCAR标记引物Z1200-F2和Z120-R2对其进行鉴定，具体方法同上，PCR电泳结果如图5所示:图中标注编号即为样品编号，编号为10、11、13、14、20、22、23、24、25的扩增到了大小为811bp条带，
PCR结果与实际雌雄状况相符，所有雄株都可以扩增的到目的条带，而雌株则没有扩增产物，进一步确定此方法可以用来鉴定罗汉果幼苗的雌雄鉴定。
【权利要求】
1.一种区分罗汉果雌雄株的方法，其特征在于:所述方法包括利用罗汉果雄株所特有的SCAR分子标记进行鉴定。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQID N0:5所/Jn ο
3.—种区分罗汉果雌雄株的PCR方法，其特征在于所述PCR方法所获得的罗汉果雄株的扩增产物包含部分或全部的如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
4.一种区分罗汉果雌雄株的方法，所述方法包括以下步骤: a)提取罗汉果的基因组DNA; b)设计引物，所述引物可以特异性扩增出罗汉果雄株所特有的部分或全部序列； c)进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物； d)检测所述PCR扩增产物； 其特征在于，所述引物的核苷酸序列选自SEQ ID N0:5或2或与其互补的核苷酸序列。
5.一种区分罗汉果雌雄株的方法，所述方法包括将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性鉴定出罗汉果雌株和雄株，其特征在于，所述探针选自SEQ ID N0:5所示的部分序列。
6.一种鉴定罗汉果雌雄株的DNA引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID N0:5或2或与其互补的核苷酸序列。
7.权利要求6所述的DNA引物，其中所述的引物如SEQID N0:6或7所示。
8.一种鉴定罗汉果雌雄株的核苷酸探针，其特征在于，所述探针选自SEQ ID N0:5或与其互补的核苷酸序列。
9.一种用于检测罗汉果雌雄株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6或7所述的引物。
10.一种鉴别罗汉果雌雄株的SCAR分子标记，其特征在于所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
11.权利要求1-2之任一所述的鉴定方法、权利要求3所述的PCR方法、权利要求4所述的方法、权利要求5所述的方法、权利要求6-7之任一所述的DNA引物、权利要求8所述的核苷酸探针、权利要求9所述的试剂盒、或权利要求10所述的SCAR分子标记在无毒罗汉果种苗生产中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104073550SQ201310108992
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】张会新, 张继贤 申请人:北京泰朗嘉懋科技发展有限公司