一种由尿液dna无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测胎儿染色体非整倍的方法，尤其涉及一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法。本发明通过孕妇尿液中游离DNA提取结合高通量测序及生物信息分析，可以检测胎儿染色体是否非整倍，从而辨别胎儿是否患唐氏综合症，真正实现了检测的无创伤性，被检测者依从度更高。
【专利说明】一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测胎儿染色体非整倍的方法，尤其涉及一种由尿液DNA无创伤 性检测胎儿染色体非整倍的方法。
【背景技术】
[0002] 染色体非整倍体异常在遗传性疾病中发生率高且严重影响出生人口质量，细胞遗 传学分析是用于怀疑染色体异常胎儿高风险孕妇的常规检查，能准确地检测非整倍体异 常，准确率高达99. 5%。但传统的染色体疾病检测多采用羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样等 方法获取胎儿细胞，以培养其细胞用于核型分析，其操作带有创伤性，还有可能造成宫内感 染，流产等并发症，而且还需要一段时间从培养的胎儿细胞中制备中期染色体，耗时长、技 术要求高，给病人造成一定的恐惧心理，为产前诊断带来不便，正因为如此，作为创伤性诊 断时都要有一定指征，并不适合每一位孕妇，其推广应用有一定的局限性，因此寻找一种既 安全又准确的无创产前诊断方法是从事产前诊断工作者的当务之急。
[0003] 自2008年，香港中文大学的卢煜明教授实验室率先采用新一代测序的方法，对母 体外周血中的游离DNA进行高通量测序，然后利用生物信息的方法，分析母体和胎儿DNA中 21号染色体上DNA片段比例准确分析胎儿是否患有唐氏综合征[1]。从此开创了利用无 需羊穿、绒毛膜、脐血穿刺等创伤性检测，直接测序分析母体外周血游离DNA来检测胎儿染 色体疾病的技术。利用外周血的游离DNA来做检测胎儿染色体疾病无需进行侵入性检测、 感染风险小、检测周期短等优点。但由于母体外周血中胎儿DNA的含量不高，一般为10% 左右，因此在样本前处理的过程中，如果实验不当、或样本保存不周便会造成母体血细胞溶 血，大量的母体细胞DNA进入血浆，进而大大稀释了胎儿DNA的含量，即会造成检测难度加 大，降低了检测灵敏度。故抽血后的样本前处理非常重要，不管是立即离心分离血浆还是采 用streak公司生产的特殊血浆保存管，都有母体样本潜在溶血的风险。因此寻找是否有更 好的无创检测手段成为国内外科学家共同的研究目标。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法， 真正实现了检测的无创伤性，被检测者依从度更高。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决： 一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法，包括以下步骤： 1) 孕妇样本选择：选择孕周大于12周、外周血胎儿游离DNA含量稳定并随着孕周逐步 增加的孕妇； 2) 孕妇尿液分离：留取孕妇中段尿50ml，立即平均转移到两个50ml的BD管，2000g离 心力离心20分钟，吸取上清备用； 3) 孕妇尿液中游离DNA提取； 4) 通过若干正常孕妇尿液游离DNA高通量测序数据库与若干唐氏综合症患儿孕妇尿 液游离DNA高通量测序数据库的构建并对比建立21号染色体非整倍体数据； 5) 对待检测者的尿液游离DNA进行高通量测序； 6) 生物信息分析得出胎儿染色体是否非整倍：若待检测者的尿液游离DNA的21号染 色体含量落入非整倍体数据范围，则为非整倍体。
[0006] 通过孕妇尿液中游离DNA提取结合高通量测序及生物信息分析，可以检测胎儿染 色体是否非整倍，从而辨别胎儿是否患唐氏综合症，真正实现了检测的无创伤性，被检测者 依从度更高。
[0007] 进一步的，所述步骤3)采用磁珠法提取，具体包括以下步骤： (1) 裂解：在2-20ml尿液中中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振荡混匀10秒，再向全血 中加入4ml裂解液，振荡混匀，56°C下温育10分钟，获得混合液； (2) 核酸吸附：向上述步骤（1)所得混合液中加入6ml结合液，充分混匀后再加入20 μ L 磁珠悬浮液，充分混匀2分钟，形成含有磁珠-DNA的复合体溶液，将上述复合体溶液置于磁 架上静置吸附1~2分钟，弃上清液，获得磁珠-DNA的复合体； (3) 漂洗：向上述磁珠-DNA的复合体中加入10ml终浓度组成为1?4 mol/L盐酸胍、 0. 2?2mol/L醋酸钠、体积终浓度3(Γ70%的无水乙醇、pH值4. (Γ 6. 0、以水为溶剂的漂洗夜， 振荡重悬磁珠10秒，在磁架上静置吸附1~2分钟，弃上清，再加入10ml体积浓度为70%的 无水乙醇水溶液的漂洗液，振荡重悬磁珠10秒，在磁架上静置吸附1~2分钟后，弃上清，室 温静置至无乙醇气味，获得漂洗后的磁珠-DNA的复合体； (4) 洗脱：最后向步骤（3)漂洗后的磁珠-DNA的复合体中加入0. 5-1. 5ml洗脱液，振荡 混匀20秒，55°C孵育5分钟，振荡混匀5秒，在磁架上静置吸附1~2分钟，取上清，获得所述 游离DNA。
[0008] 尿液中的DNA片段较短，因此现有的纯化富集效果不理想，磁珠法提取对于尿液 中存在的5(Tl00bp左右的DNA纯化效果较为理想。
[0009] 更进一步的，所述磁珠悬浮液按如下方法制备：（1)磁性粒子的配制：首先对 4mol/L的氢氧化钠水溶液通氮气进行除氧处理，然后将氢氧化钠水溶液置于80°C的水浴 中并持续通入氮气；其次，将0. 5mol/L氯化铁水溶液与0. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液以体积 比2:1混合，缓慢倒入上述水浴中的氢氧化钠水溶液中，搅拌反应30分钟，将反应液静置冷 却沉淀，去除上清；最后取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性 粒子；所述氢氧化钠水溶液与氯化铁水溶液和氯化亚铁盐酸溶液的总体积比为1:0. 6 ; (2) 磁性粒子修饰配基：取上述磁性粒子用去离子水进行超声分散，获得磁性粒子分散液，向所 述磁性粒子分散液中分别加入无水乙醇、质量浓度22~25%浓氨水、体积浓度40%的正硅酸 乙酯的乙醇溶液，在400rpm下搅拌24小时，将反应混合液用乙醇与水分别清洗三次，最后 用4ml去离子水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述去离子水的体积用量以磁性粒子质量计 为100ml/g，所述无水乙醇体积用量以磁性粒子质量计为400ml/g，浓氨水体积用量以磁性 粒子质量计为5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g。
[0010] 利用这种方法制得的磁珠悬浮液，加强了小片段DNA的吸附能力，平均10ml尿液 含游离DNA 5ng，经试验表明可以用于检测胎儿染色体非整倍。
[0011] 本发明的有益效果是：通过孕妇尿液游离DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍， 真正实现了检测的无创伤性，被检测者依从度更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的尿液DNA提取效果图； 图2是正常人染色体组与唐氏综合征胎儿染色体组的21号染色体百分含量对比图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步详细描述： 实施例1 : 一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法，包括以下步骤： 1)孕妇样本选择：选择孕周大于12周的孕妇，此时外周血胎儿游离DNA含量稳定并随 着孕周逐步增加。
[0014] 以下孕妇不在选择之列： ?孕妇自身存在染色体结构异常； ?怀有双胎或者多胎的孕妇； ?一年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或在四周内接受过外源DNA治疗的孕 妇； ?通过体外受精-胚胎移植（IVF-ET)方式受孕的孕妇； ?体重大于l〇〇Kg的孕妇； ?孕妇患恶性肿瘤患。
[0015] 2)孕妇尿液分离 留取孕妇中段尿50ml，立即平均转移到两个50ml的BD管，2000g离心力离心20分钟， 吸取上清以备后续实验。
[0016] 3)孕妇尿液DNA提取 (1) 裂解：在2-20ml尿液中中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振荡混匀10秒，再向全血 中加入4ml裂解液，振荡混匀，56°C下温育10分钟，获得混合液； (2) 核酸吸附：向上述步骤（1)所得混合液中加入6ml结合液，充分混匀后再加入20 μ L 磁珠悬浮液，充分混匀2分钟，形成含有磁珠 -DNA的复合体溶液，将上述复合体溶液置于磁 架上静置吸附1~2分钟，弃上清液，获得磁珠 -DNA的复合体； (3) 漂洗：向上述磁珠 -DNA的复合体中加入10ml终浓度组成为1?4 mol/L盐酸胍、 0. 2?2mol/L醋酸钠、体积终浓度3(Γ70%的无水乙醇、pH值4. (Γ 6. 0、以水为溶剂的漂洗夜， 振荡重悬磁珠10秒，在磁架上静置吸附1~2分钟，弃上清，再加入10ml体积浓度为70%的 无水乙醇水溶液的漂洗液，振荡重悬磁珠10秒，在磁架上静置吸附1~2分钟后，弃上清，室 温静置至无乙醇气味，获得漂洗后的磁珠 -DNA的复合体； (4) 洗脱：最后向步骤（3)漂洗后的磁珠 -DNA的复合体中加入0. 5-1. 5ml洗脱液，振荡 混匀20秒，55°C孵育5分钟，振荡混匀5秒，在磁架上静置吸附1~2分钟，取上清，获得所述 游离DNA。
[0017] 磁珠悬浮液按如下方法制备：（1)磁性粒子的配制：首先对4mol/L的氢氧化钠水 溶液通氮气进行除氧处理，然后将氢氧化钠水溶液置于80°C的水浴中并持续通入氮气；其 次，将0. 5mol/L氯化铁水溶液与0. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液以体积比2:1混合，缓慢倒入 上述水浴中的氢氧化钠水溶液中，搅拌反应30分钟，将反应液静置冷却沉淀，去除上清；最 后取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氢氧化钠水 溶液与氯化铁水溶液和氯化亚铁盐酸溶液的总体积比为1 :〇. 6 ; (2)磁性粒子修饰配基：取 上述磁性粒子用去尚子水进行超声分散，获得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中 分别加入无水乙醇、质量浓度22~25%浓氨水、体积浓度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在 400rpm下搅拌24小时，将反应混合液用乙醇与水分别清洗三次，最后用4ml去离子水分散， 获得所述磁珠悬浮液；所述去离子水的体积用量以磁性粒子质量计为l〇〇ml/g，所述无水 乙醇a体积用量以磁性粒子质量计为400ml/g，浓氨水体积用量以磁性粒子质量计为5ml/ g，正硅酸乙酯的乙醇溶液体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g。
[0018] 利用本实施例中的磁珠悬浮液，加强了小片段DNA的吸附能力，平均10ml尿液含 游离DNA 5ng。Angilent 2100的检测结果可以看到200bp以下有DNA条带存在，如图1所 /_J、1 〇
[0019] 4)通过10个正常孕妇尿液游离DNA高通量测序数据库与9个唐氏综合症患儿孕 妇尿液游离DNA高通量测序数据库的构建并对比建立21号染色体非整倍体数据： 利用BWA软件将所有测序所得序列去人类基因组参考序列进行基因组比对，比对序列 长度为36碱基，不允许有错配和Gap，得到每个染色体对应的reads数目，计算每个样品中 每条染色体所在的百分比，我们选用染色体核型分析正常的孕妇10个样本的数据建立正 常基因组的参考值，然后选用9个21三体样本进行t-test分析，发现21三体的人群中21 号染色体的百分含量与正常人有显著差异（P=〇. 03502)，如图2所示； 5) 对待检测者的尿液游离DNA进行高通量测序； 6) 生物信息分析得出待检测者的胎儿染色体是否非整倍：若待检测者的尿液游离DNA 的21号染色体含量落入非整倍体数据范围，则为非整倍体。
[0020] 其中测序文库的构建采用以下步骤： (1)末端修整 a) 配制如下反应体系：
【权利要求】
1. 一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法，其特征在于：包括以下步 骤： 1) 孕妇样本选择：选择孕周大于12周、外周血胎儿游离DNA含量稳定并随着孕周逐步 增加的孕妇； 2) 孕妇尿液分离：留取孕妇中段尿50ml，立即平均转移到两个50ml的BD管，2000g离 心力离心20分钟，吸取上清备用； 3) 孕妇尿液中游离DNA提取； 4) 通过若干正常孕妇尿液游离DNA高通量测序数据库与若干唐氏综合症患儿孕妇尿 液游离DNA高通量测序数据库的构建并对比建立21号染色体非整倍体数据； 5) 对待检测者的尿液游离DNA进行高通量测序； 6) 生物信息分析得出待检测者的胎儿染色体是否非整倍：若待检测者的尿液游离DNA 的21号染色体含量落入非整倍体数据范围，则为非整倍体。
2. 根据权利要求1所述的一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法，其 特征在于：所述步骤3)采用磁珠法提取，具体包括以下步骤： (1) 裂解：在2-20ml尿液中中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振荡混匀10秒，再向全血 中加入4ml裂解液，振荡混匀，56°C下温育10分钟，获得混合液； (2) 核酸吸附：向上述步骤（1)所得混合液中加入6ml结合液，充分混匀后再加入20 μ L 磁珠悬浮液，充分混匀2分钟，形成含有磁珠-DNA的复合体溶液，将上述复合体溶液置于磁 架上静置吸附1~2分钟，弃上清液，获得磁珠-DNA的复合体； (3) 漂洗：向上述磁珠-DNA的复合体中加入10ml终浓度组成为1?4 mol/L盐酸胍、 0. 2?2mol/L醋酸钠、体积终浓度3(Γ70%的无水乙醇、pH值4. (Γ 6. 0、以水为溶剂的漂洗夜， 振荡重悬磁珠10秒，在磁架上静置吸附1~2分钟，弃上清，再加入10ml体积浓度为70%的 无水乙醇水溶液的漂洗液，振荡重悬磁珠10秒，在磁架上静置吸附1~2分钟后，弃上清，室 温静置至无乙醇气味，获得漂洗后的磁珠-DNA的复合体； (4) 洗脱：最后向步骤（3)漂洗后的磁珠-DNA的复合体中加入0. 5-1. 5ml洗脱液，振荡 混匀20秒，55°C孵育5分钟，振荡混匀5秒，在磁架上静置吸附1~2分钟，取上清，获得所述 游离DNA。
3. 根据权利要求2所述的一种由尿液DNA无创伤性检测胎儿染色体非整倍的方法，其 特征在于：所述磁珠悬浮液按如下方法制备：（1)磁性粒子的配制：首先对4mol/L的氢氧 化钠水溶液通氮气进行除氧处理，然后将氢氧化钠水溶液置于80°C的水浴中并持续通入氮 气；其次，将〇. 5mol/L氯化铁水溶液与0. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液以体积比2:1混合，缓 慢倒入上述水浴中的氢氧化钠水溶液中，搅拌反应30分钟，将反应液静置冷却沉淀，去除 上清；最后取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氢 氧化钠水溶液与氯化铁水溶液和氯化亚铁盐酸溶液的总体积比为1:0. 6 ; (2)磁性粒子修 饰配基：取上述磁性粒子用去离子水进行超声分散，获得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子 分散液中分别加入无水乙醇、质量浓度22~25%浓氨水、体积浓度40%的正硅酸乙酯的乙醇 溶液，在400rpm下搅拌24小时，将反应混合液用乙醇与水分别清洗三次，最后用4ml去离 子水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述去离子水的体积用量以磁性粒子质量计为l〇〇ml/g， 所述无水乙醇体积用量以磁性粒子质量计为400ml/g，浓氨水体积用量以磁性粒子质量计 为5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g。
【文档编号】C12Q1/68GK104195241SQ201410406896
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】苗正友 申请人:嘉兴市妇幼保健院