专利名称：：一种快速鉴别鳙鱼幼苗性别的分子生物学方法
技术领域：
：本发明涉及一种分子生物学，特别是一种快速鉴别鳙鱼幼苗性别的分子生物学方法。
背景技术：
：我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，因此，开展这些鱼类性别决定相关基因及性别特异标记的研究对于鱼类性别控制具有很高的理论指导意义。鳙(Aristichthysmobilis)属鲤形目，鲤科，鲢亚科，鳙属。俗称花鲢，胖头鱼，黑鲢，黄鲢，松鱼，鎔鱼，大头鱼。鱼名，鳙鱼，又名“胖头鱼”、“花鲢”、“黑鲢”，头很大，生活在淡水中。鳙生长迅速，3龄鱼可达4-5公斤，最大个体可达40公斤，天然产量很高。疾病少，易饲养，是我国淡水养殖业中的“四大家鱼”之一，为我国重要经济鱼类。鳙鱼雌性生长发育快，生长迅速。目前人工雌核发育与激素性反转结合创造全雌性的养殖群体是鳙鱼育种的主要方向。但是由于鳙鱼第一次性成熟需45年，在幼苗时期根本无法通过外观形态来判断其性别特征，所以怎样从幼苗群体中，简单快速的识别出遗传性别成为鳙鱼成功选育的先决条件。RAPD技术是近几年出现的，可以快速寻找分子标记的一种有效方法。用它在某些动物的基因组中寻找性别标记已有成功报道。如在虹鳟鱼基因组中找到了两个雄性特异的分子标记，可以作为识别雌雄的探针。Kovacs等2000年用RAPD扫描非洲鲶鱼(Clariasgariepinus)雌、雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记。但目前国内外尚无有关分子标记鉴别鳙鱼幼苗性别方法的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种对鳙鱼雌性特异性引物序列。本发明的另一个目的是提供一种能快速鉴别鳙鱼幼苗性别的分子生物学方法。本发明的技术方案是，鳙鱼雌性特异性引物序列，其特征在于其特异性引物序列为上游5’CGCATACTCMACATCACATAC3’;下游5’TCACTCACTGTCTGCTCACTG3’。利用设计的特异引物序列以鳙鱼个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25ul，反应组成为IU的TaqDNA聚合酶，2ul的dNTP，100200ng基因组DNA，其中含雌性特异上下游引物各0.1μmol/L，在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增95°C预变性5min后，94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30个循环，最后72°C延伸lOmin，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，lOObpDNAladder作分子量标记，出现大小为518bp目的带的是雌性个体，没有条带的即为雄性个体。本发明与现有技术比较具有能在鳙鱼幼苗期快速准确鉴别出性别的显著优点。图1为利用特异PCR法对性别特异片段的验证电泳结果图。在雌雄10个个体中，对照基因条带在所有个体中清晰可见，证明PCR扩增程序没有问题。1,2,3,4,5除管家基因外没有扩增出任何条带，均为雄性个体。而6，7，8，9，10泳道都出现了大小为518bp的扩增带，均为雌性个体；M为IOObp梯度的DNA分子量标准。箭头1所指为大小为518bp的雄性特异条带；箭头2所指为对照基因条带。图2为利用雌性特异引物对鳙鱼幼苗性别鉴定电泳结果图。随机选取24个鳙鱼幼苗个体进行性别鉴定。其中1，2，3，4，5，6，11，12，13，14，16，18，19，21，22，23，24十七个个体的电泳带上有一个518bp大小的条带，为雌性个体；7，8，9，10，15，17，20七个个体在518bp位置上没有条带，为雌性个体。M为IOObp梯度的DNA分子量标准。箭头1所指为大小为518bp的雄性特异条带；箭头2所指为对照基因条带。具体实施例方式1.雌性特异引物的获得以及性别特异性的验证性腺解剖鉴定性别后，提取雌雄个体基因组DNA，利用220条随机引物进行RAPD-PCR扩增，当使用到随机引物S2120时，在雌性个体中扩增出一个稳定的谱带，该带纹在雄性个体中不存在。该条带即为鳙鱼雌性特异条带，通过克隆和测序获得了一段约518bp的雌性特异片段，命名为AmfT(其DNA序列如表1)，该片段属非编码序列，将该序列在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的序列。测序后设计一对雌性特异引物Amff1和Amff2，通过NCBI搜索鳙鱼的GAPDH对照基因，设计一对能作为PCR内部对照的引物(序列为5，GCCTCCTGCACCACCAACTG3，和5，CGGAAGGCCATGCCGGTCAG3，)。利用设计好的特异引物及对照基因引物在10个已知性别的个体中进行特异PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性5min后，94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增产物4°C保存。结果如图1所示，在雌雄10个个体中，对照基因条带在所有个体中清晰可见，证明PCR扩增程序没有问题。1，2，3，4，5均为雄性个体，除管家基因外没有扩增出任何条带。而6，7，8，9，10均为雌性个体，泳道都出现了大小为518bp的扩增带；这表明本发明设计的引物和方法能够用于鳙鱼性别的鉴定。2.鳙鱼幼苗性别的鉴别将实验鱼静脉抽血少许(不超过0.5ml)，加至少两倍的抗凝剂A⑶，4000rpm离心IOmin,去上清；加入5ml裂解液及20μgRNA酶，37温育3h；加蛋白酶K至终浓度100μg/μ1，50°C过夜。经酚一酚·氯仿异戊醇一氯仿·异戊醇依次抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤。干燥后，将鳙鱼基因组DNA溶于TE或无菌双蒸水中，分别编号。利用设计的雌性特异引物对24个未知性别鲢鱼幼苗个体进行PCR扩增，反应体系为25μ1，IUTaq酶，2μ1dNTP，100200ng基因组DNA，雌性特异上下游引物各0.1μmol/L。循环参数为95°C预变性5min后，94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录。如图2发现17个出现大小为518bp目的带的是雌性个体，其它7个没有条带的即为雄性个体。以上均表明本发明设计的特异引物和方法能够用于鲢鱼幼苗雌雄性别的鉴别。表1.鳙鱼雌性特异片段Amff序列CGCATACTCAAACATCACATACAAAAGCAACAAAAAAAAGGCAATGCACCGAGAAGCCACAAAACAGTGTAAAGAAATGAAAGCGTGATGCGTCATGTAGTATGAACAGACTTTAAAGTCATATTCACAGCATATCCACATATTTGGGATGACATAAATACATGCATTAGGCTTTTTTTAAATGAAATAATAATAACTCTGAATTCACACTAAGCCTGAAATGTCACTGCAATATTTTTATTAAAAATAAATAATTATATGTATTATTGACTATTTAAATTTAAATTATGCATTGGTTTTAGTGTGAATAATTTAAGTGTGAAAAATTACAGTGAAAATAAGACATTCTATAGTTTCAGATTTGGTGTGAACAGGCATTAACTGAAGCAGAGCGAAGATGAAGCCATCTGTTACAGCAGATGAGTGTACAATTTGAAAACAATGACAGTTTATGGAAGATTTGCTTTTGGGAAATGACTGCATAAAGCGGCACAAAGCAGTGAGCAGACAGTGAGTGA表2.鳙鱼雌性特异性引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求鳙鱼雌性特异性引物序列，其特征在于其特异性引物序列为上游5’CGCATACTCAAACATCACATAC3’；下游5’TCACTCACTGTCTGCTCACTG3’。2.一种快速鉴别鳙鱼幼苗性别的分子生物学方法，其特征在于利用设计的特异引物序列Amffl:5’CGCATACTCAAACATCACATAC3’；Amff2:5’TCACTCACTGTCTGCTCACTG3，，以鳙鱼个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25ul，反应组成为IU的TaqDNA聚合酶，2ul的dNTP，100200ng基因组DNA，其中含雌性特异上下游引物各0.1μmol/L,在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增95°C预变性5min后，94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec共30个循环，最后72°C延伸lOmin，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，IOObpDNAladder作分子量标记，出现大小为518bp目的带的是雌性个体，没有条带的即为雄性个体。全文摘要一种快速鉴别鳙鱼幼苗性别的分子生物学方法，涉及一种分子生物学，本发明的目的是提供一种能快速鉴别鳙鱼幼苗性别的分子生物学方法。本发明的技术方案要点是，以鳙鱼个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，100bpDNAladder作分子量标记，出现大小为518bp目的带的是雌性个体，没有条带的即为雄性个体。本发明用于鉴别鳙鱼幼苗的性别。文档编号C12Q1/68GK101805785SQ20091020780公开日2010年8月18日申请日期2009年10月30日优先权日2009年10月30日发明者夏晓华,常重杰,杜启艳,王友利,陈建军申请人:河南师范大学